[發明專利]一種雞腦乙酰膽堿酯酶的雙水相萃取方法及其對氨基甲酸酯類農藥的敏感性檢測方法

在審

• 申請號: 201610147845.2
• 申請日: 2016-03-15
• 公開（公告）號: CN105624132A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 黃惠華;張佳佳
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12Q1/46
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍

技術領域

本發明涉及氨基甲酸酯類農藥殘留的檢測領域，具體涉及一種雞腦乙酰膽堿酯酶的雙水相萃取方法及其對氨基甲酸酯類農藥的敏感性檢測方法。

背景技術

自從高度有機氯農藥被禁止使用，氨基甲酸酯類農藥是目前我國使用最主要的農藥之一。近年來，農藥的大量使用引發的中毒事件頻繁發生，引起各國政府和公眾的廣泛關注。我國于2014年3月發布的國家標準《食品中農藥最大殘留限量》中重新明確規定了各種氨基甲酸酯類農藥的殘留限量。由此可見氨基甲酸酯類有毒成分的分析檢測尤為重要。

現在酶抑制法作為氨基甲酸酯類有毒成分殘留的主要測定方法，具有簡便、快捷及成本低廉等優點。檢測用酶是酶抑制法的核心和關鍵，當前商品酶主要是從家蠅等敏感昆蟲頭部提取，產量低、成本高，難以滿足檢測的需求。因此進行來源豐富、低成本、短時間的新酶源的開發研究十分必要。雞腦是雞加工處理過程中的下腳料，來源豐富，但目前雞腦乙酰膽堿酯酶的研究較少。實驗表明，雞腦乙酰膽堿酯酶酶活高，用雞腦作為酶源進行乙酰膽堿酯酶的提取，也是對廢棄物的高值化利用。

傳統提取方法多為柱層析提取，耗時長，工藝復雜，成本高。本發明所用的雙水相萃取廣泛應用在蛋白、酶、多糖等物質的提取上，成本低、耗時短，是一種綠色的提取方法，但尚未發現應用在雞腦乙酰膽堿酯酶的提取上。

本發明用雙水相萃取雞腦乙酰膽堿酯酶，所得酶制品活性高，對氨基甲酸酯類農藥具有高度的敏感性，對氨基甲酸酯類農藥殘留的檢測具有重要意義。

發明內容

本發明提供了一種雞腦乙酰膽堿酯酶的雙水相萃取方法及其對氨基甲酸酯類農藥的敏感性檢測方法。

本發明的目的通過以下技術方案實現：

一種雞腦乙酰膽堿酯酶的雙水相萃取方法，該方法包括以下步驟：

1）將新鮮的用生理鹽水沖洗干凈的雞腦組織與含TritonX-100的磷酸鹽緩沖液按質量/體積比1：2～1：6混合，均質后靜置10～30min，離心機6000～10000r/min，0～4℃離心10～30min，取上清液，用水稀釋2～8倍后即得乙酰膽堿酯酶粗酶液；所述磷酸鹽緩沖液中TritonX-100的質量分數為0～1.0%；

2）PEG-1000/(NH₄)₂SO₄雙水相體系：體系總質量為5～15g，其中PEG-1000的質量占體系總質量的10～20%，(NH₄)₂SO₄的質量占體系總質量的10～20%，體系pH為5～7，乙酰膽堿酯酶粗酶液加入量為體系總質量的10～20%，其余成分為水，以此建立雙水相體系，攪拌5～15min后，靜置分相，以蒸餾水代替上清液加入體系中作為空白組，收集乙酰膽堿酯酶所富集的上相作為實驗組及相應的空白組上相；

3）PEG-1000/K₂HPO₄反萃取體系：體系總質量為8～10g，將收集的實驗組及空白組上相調節pH為3～7，按照2:1～6:1的體積比例加入質量體積比為30～50%K₂HPO₄鹽溶液，攪拌均勻后，靜置分相，形成新的雙水相體系，記錄上下相體積，收集下相；

4）將收集的下相用磷酸鹽緩沖液進行透析，將透析袋內的溶液進行真空冷凍干燥，即得雞腦乙酰膽堿酯酶的酶粉，配制成酶液后測定比活力。

進一步地，步驟3）所述的K₂HPO₄鹽溶液是通過用質量體積比為30～50%的KH₂PO₄溶液調節質量體積比為30～50%的K₂HPO₄溶液的pH至3～7所得。

進一步地，步驟4）所述的用磷酸鹽緩沖液進行透析，其中磷酸鹽緩沖液濃度為0.05～1mol/L，pH為7～9，透析時間為8～24h。

一種雞腦乙酰膽堿酯酶對氨基甲酸酯類農藥的敏感性檢測方法，具體的步驟如下：