[發明專利]一種雞腦乙酰膽堿酯酶的雙水相萃取方法及其對氨基甲酸酯類農藥的敏感性檢測方法

在審

• 申請號: 201610147845.2
• 申請日: 2016-03-15
• 公開（公告）號: CN105624132A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 黃惠華;張佳佳
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12Q1/46
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍

1.一種雞腦乙酰膽堿酯酶的雙水相萃取方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

1）將新鮮的用生理鹽水沖洗干凈的雞腦組織與含TritonX-100的磷酸鹽緩沖液按質量/體積比1：2～1：6混合，均質后靜置5~15min，離心機6000～10000r/min，0～4℃離心10～30min，取上清液，用水稀釋2～8倍后即得乙酰膽堿酯酶粗酶液；所述磷酸鹽緩沖液中TritonX-100的質量分數為0～1.0%；

2）PEG-1000/(NH₄)₂SO₄雙水相體系：體系總質量為5～15g，其中PEG-1000的質量占體系總質量的10～20%，(NH₄)₂SO₄的質量占體系總質量的10～20%，體系pH為5～7，乙酰膽堿酯酶粗酶液加入量為體系總質量的10～20%，其余成分為水，以此建立雙水相體系，攪拌5～15min后，靜置分相，以蒸餾水代替上清液加入體系中作為空白組，收集乙酰膽堿酯酶所富集的上相作為實驗組及收集相應的空白組上相；

3）PEG-1000/K₂HPO₄反萃取體系：體系總質量為8～10g，將收集的實驗組及空白組上相調節pH為3～7，按照2:1～6:1的體積比例加入質量體積比為30～50%K₂HPO₄鹽溶液，攪拌均勻后，靜置分相，形成新的雙水相體系，記錄上下相體積，收集下相；

4）將收集的下相用磷酸鹽緩沖液進行透析，將透析袋內的溶液進行真空冷凍干燥，即得雞腦乙酰膽堿酯酶的酶粉，配制成酶液后測定比活力。

2.根據權利要求1所述的一種雞腦乙酰膽堿酯酶的雙水相萃取方法，其特征在于，步驟3）所述的K₂HPO₄鹽溶液是通過用質量體積比為30～50%的KH₂PO₄溶液調節質量體積比為30～50%的K₂HPO₄溶液的pH至3～7所得。

3.根據權利要求1所述的一種雞腦乙酰膽堿酯酶的雙水相萃取方法，其特征在于，步驟4）所述的用磷酸鹽緩沖液進行透析，其中磷酸鹽緩沖液濃度為0.05～1mol/L，pH為7～9，透析時間為8～24h。

4.一種雞腦乙酰膽堿酯酶對氨基甲酸酯類農藥的敏感性檢測方法，其特征在于，具體的步驟如下：

1）半抑制濃度IC₅₀的測定：取氨基甲酸酯類農藥稀釋液加入到磷酸鹽緩沖液中，配置成不同的濃度梯度0、0.004~0.006、0.009~0.011、0.09~0.11、0.4~0.6、0.9~1.1μg/mL，得不同濃度的氨基甲酸酯類農藥溶液，在各濃度的氨基甲酸酯類農藥溶液中分別取兩組1～10mL于試管中，然后向其中一組各濃度的氨基甲酸酯類農藥溶液中分別加入雞腦乙酰膽堿酯酶酶液0.05～1mL，再向余下一組各濃度的氨基甲酸酯類農藥溶液中分別加入商品乙酰膽堿酯酶酶液0.05～1mL，其中一管以蒸餾水代替酶液作為空白對照，混勻后于30～40℃水浴保溫5～20min，加入DTNB溶液和ATCHI各0.05～1mL，混勻后立即在400～500nm處測定酶活，并計算抑制率，以農藥濃度的對數lgC對抑制率I作圖，求出乙酰膽堿酯酶的IC₅₀；

2）雙分子速率常數K_i的測定：分別取兩份0.05～1mL雞腦乙酰膽堿酯酶酶液于試管A、B中，再分別取兩份0.05～1mL商品乙酰膽堿酯酶酶液于試管C、D中，然后在試管A、C中加入1～10mL0.05～1μg·mL^-1氨基甲酸酯類農藥稀釋液，在試管B、D中加入蒸餾水代替農藥作為空白對照，測定四支試管在不同反應時間后的酶活，根據公式分別計算三支試管的K_i，取平均值，

式中，K_i為雙分子速率常數；E₁為不加農藥的酶活；E₂為加農藥的酶活；M為農藥的濃度，轉化為摩爾濃度；t為反應時間。