[發(fā)明專利]表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201610147339.3 | 申請(qǐng)日： | 2016-03-15 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN105695423B | 公開(kāi)（公告）日： | 2018-04-27 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 王笑梅;李凱;劉長(zhǎng)軍;張艷萍;崔紅玉;祁小樂(lè);高立;高玉龍;王永強(qiáng);高宏雷 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 |
| 主分類號(hào)： | C12N7/01 | 分類號(hào)： | C12N7/01 |
| 代理公司： | 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司11139 | 代理人： | 孫皓晨,馬鑫 |
| 地址： | 150001 黑龍*** | 國(guó)省代碼： | 黑龍江;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 表達(dá) 傳染性 法氏囊 病毒 vp2 基因 重組 雞馬立克氏病 疫苗 及其 構(gòu)建 方法 應(yīng)用 | ||
1.表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株，其特征在于是將包含傳染性法氏囊病毒VP2基因和CAG啟動(dòng)子序列的表達(dá)框架CAG-VP2插入到雞馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株的US2基因內(nèi)部，獲得在US2基因內(nèi)部插入CAG-VP2表達(dá)框架的重組粘粒，由其拯救獲得表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株，其中，US2基因缺失了其中第15至630位的核苷酸，代之以插入CAG-VP2表達(dá)框架，所述的CAG-VP2表達(dá)框架的結(jié)構(gòu)為CMV增強(qiáng)子-雞β-actin啟動(dòng)子-VP2基因-sv40PolyA，所述的CAG-VP2表達(dá)框架的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株，其特征在于，所述的表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株，命名為rMDV-VP2，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為：CGMCC No.12009。
3.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株的方法，其特征在于包括以下步驟：
(1)構(gòu)建馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遺傳操作系統(tǒng)
所述系統(tǒng)包含5個(gè)分別依次含有馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因組1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位核苷酸序列的重組粘粒，其中所述的馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株全基因組序列的GeneBank登錄號(hào)為JF742597，所述系統(tǒng)中的5個(gè)重組粘粒是通過(guò)將馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因組1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位核苷酸序列與pCC1Fos載體連接后得到的，分別命名為p814-1、p814-2、p814-3、p814-4以及p814-5，其中p814-5包含馬立克氏病病毒的US2基因，US2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
(2)含有CAG-VP2表達(dá)框架的重組突變粘粒p814-5US2VP2的構(gòu)建
在步驟(1)構(gòu)建得到的重組粘粒p814-5中的US2基因內(nèi)部插入CAG-VP2表達(dá)框架并替換US2基因的第15至630位核苷酸得到含有CAG-VP2表達(dá)框架的重組突變粘粒p814-5US2VP2，CAG-VP2表達(dá)框架的結(jié)構(gòu)為CMV增強(qiáng)子-雞β-actin啟動(dòng)子-VP2基因-sv40PolyA，所述的CAG-VP2表達(dá)框架的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示；
(3)表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株的拯救
對(duì)得到的重組粘粒p814-1、p814-2、p814-3、p814-4以及p814-5US2VP2五個(gè)粘粒進(jìn)行線性化處理，通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法將五個(gè)粘粒共轉(zhuǎn)染次代CEF，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染4h后，棄掉細(xì)胞上清，用DMEM將細(xì)胞洗一遍；加入2ml甘油休克液，室溫孵育2min；用DMEM洗滌3次后，加入含10％FBS的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，休克12h后，將細(xì)胞培養(yǎng)液換為含3％FBS、1％雙抗的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染4-5天后盲傳2代可觀察到細(xì)胞病變的出現(xiàn)，拯救出的重組病毒即為表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株。
4.權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株在制備預(yù)防和治療雞馬立克氏病和雞傳染性法氏囊病藥物中的用途。
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