[發明專利]基于乳液PCR的大片段單分子簇擴增技術

在審

• 申請號: 201610146564.5
• 申請日: 2016-03-15
• 公開（公告）號: CN105671031A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 鄭洪坤;安峰;劉慧;郭煥煥
• 申請（專利權）人: 北京百邁客生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明屬于生物化學領域，具體的，涉及一種基于乳液PCR的大 片段單分子簇擴增技術。

背景技術

PCR技術是通過酶促反應體外合成DNA片段的方法，能夠迅速獲 得所需片段，具有操作簡便、靈敏度高、特異性強等特點。PCR技術 已經被應用于多個領域，如基因表達分析、核酸序列分析以及當前的 疾病診斷等。在PCR技術基礎上衍生出各種分支技術，乳液PCR技術 就是其中之一，乳液PCR主要是通過將PCR反應所有成分注入快速旋 轉的油相表面，從而在一個反應體系中形成數目龐大的微反應器，使 得每個微反應器中有少量的模板，從而減少模板間、引物間的相互干 擾，最大化試劑的利用率，提高PCR反應的特異性。其應用領域也是 相當廣泛，包括可以輔助形成高通量測序過程中的單分子簇、使多重 PCR中每種PCR產物相對均衡等。雖然該技術的優勢明顯、應用廣泛， 但由于其僅適用于較短的擴增長度，所以限制了其在更多方面的應 用。雖然目前用于長片段擴增的DNA聚合酶已經很多，擴增的最長片 段達到幾十Kbp，但是實際擴增過程中的情況卻是常常難以獲得理想 的擴增效果，得到的擴增條帶也經常有非特異帶甚至彌散帶，所以不 能滿足大片段擴增的需求。

因此有必要對乳液PCR技術進行優化，增加乳液PCR技術的擴增 長度，擴展乳液PCR的應用范圍，從而為進一步拓展乳液PCR技術的 應用領域提供有效手段。

發明內容

本發明的目的在于解決現有的乳液PCR技術所存在的難以擴增 獲得特異性長片段的缺陷，發明一種新的大片段單分子簇擴增方法。

為此，本發明提供了一種基于乳液PCR技術的大片段單分子簇擴 增方法，所述方法包括：將攜帶有生物素標記的PCR引物與磁珠進行 結合孵育，使引物吸附于磁珠表面形成引物簇，利用所述引物簇進行 乳液PCR反應。

本發明中對于PCR引物進行生物素標記的方法沒有特別的限制， 可以利用本領域常規的標記方法進行。

可選的，所述磁珠為T1磁珠或M270磁珠。

在本發明的一種優選的實施方式中，所述PCR引物的核苷酸序列 如SEQIDNO.3所示。

可選的，結合孵育的體系為：

可選的，所述結合孵育的條件為將所述攜帶有生物素標記的PCR 引物與磁珠在20-25℃孵育5-20min。清洗磁珠4-5次，清洗的方法為用 1×BeadsWashBuffer清洗兩次，ddH₂O洗2-3次。

在本發明所提供的方法中，乳液PCR反應體系由預先各自配制好 的水相和油相混合制成。在所述乳液PCR反應體系中，包括引物簇以 及游離引物，所述游離引物不帶有生物素標記，游離引物的核苷酸序 列與引物簇中磁珠上所吸附的PCR引物相同。游離引物的作用為增加 微反應體系中單分子模板的數量，模板數量的增多會增大模板與磁珠 上引物的碰撞幾率，使得擴增反應更容易發生。

可選的，乳液PCR反應體系的水相包括：

在本發明所提供的方法中，所述游離PCR引物為未經過生物素標 記的PCR引物。

本發明所提供的方法還包括預先對基因組DNA進行破碎獲得 5-8Kbp的大片段，利用所述大片段進行文庫構建獲得大片段文庫作為 模板DNA。

本發明中，對于文庫構建的方式沒特別的限制，可以按照本領域 常規的方法進行構建。

在本發明的一種優選的實施方式中，可以按照以下步驟構建大片 段文庫：將超聲破碎后的大片段用AMPurebeads進行純化，試劑盒進 行大片段文庫構建，經過末端修復加A尾后，加接頭，接頭序列優選 如SEQIDNO.1-2所示。用0.6％瓊脂糖凝膠電泳分離核酸片段，切取 4Kbp、5Kbp或6Kbp附近的片段，用試劑盒回收目的片段獲得大片段 文庫。

可選的，乳液PCR反應的條件包括：94℃預變性1min；98℃變 性10sec，68℃退火延伸4min，15-25個循環；72℃延伸5min；可根 據實際需求選擇具體循環數。

優選的，為了獲得更好的擴增效果，增加產物量、減少非特異性 帶和彌散帶的產生，在擴增過程中，升溫速度為1.0-1.5℃/s，降溫速 度為1.5-2.4℃/s。