[發明專利]基于乳液PCR的大片段單分子簇擴增技術在審
| 申請號： | 201610146564.5 | 申請日： | 2016-03-15 |
| 公開（公告）號： | CN105671031A | 公開（公告）日： | 2016-06-15 |
| 發明（設計）人： | 鄭洪坤;安峰;劉慧;郭煥煥 | 申請（專利權）人： | 北京百邁客生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 北京路浩知識產權代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君 |
| 地址： | 101300 北京市順*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 基于 乳液 pcr 片段 子簇 擴增 技術 | ||
1.一種基于乳液PCR的大片段單分子簇擴增方法，其特征在于， 所述方法包括：將攜帶有生物素標記的PCR引物與磁珠進行結合孵 育，使引物吸附于磁珠表面形成引物簇，利用所述引物簇進行乳液 PCR反應。
2.根據權利要求1所述的大片段單分子簇擴增方法，其特征在于， 所述結合孵育的條件為將所述攜帶有生物素標記的PCR引物與磁珠 在20-25℃孵育5-20min。
3.根據權利要求1或2所述的大片段單分子簇擴增方法，其特征 在于，乳液PCR反應體系的水相包括：
4.根據權利要求3所述的大片段單分子簇擴增方法，其特征在于， 所述游離PCR引物為未經過生物素標記的PCR引物。
5.根據權利要求3所述的大片段單分子簇擴增方法，其特征在于， 乳液PCR反應的條件包括：
94℃預變性1min；98℃變性10sec，68℃退火延伸4-6min，15-25 個循環；72℃延伸5min。
6.根據權利要求5所述的大片段單分子簇擴增方法，其特征在于， 在擴增過程中，升溫速度為1.0-1.5℃/s，降溫速度為1.5-2.4℃/s。
7.根據權利要求4-6中任意一項所述的大片段單分子簇擴增方 法，其特征在于，所述方法包括對基因組DNA進行破碎獲得5-8Kbp 的大片段，利用所述大片段進行文庫構建獲得大片段文庫，以大片段 文庫作為模板DNA。
8.根據權利要求7所述的大片段單分子簇擴增方法，其特征在于， 乳液PCR反應所使用的DNA聚合酶為KAPA、NEB或KOD。
9.根據權利要求1、2、4-6和8中任意一項所述的大片段單分子 簇擴增方法，其特征在于，PCR引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所 示。
10.根據權利要求9所述的大片段單分子簇擴增方法，其特征在 于，所述磁珠為T1磁珠或M270磁珠。
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