[發明專利]NDV/H9-AIV/IBV三重熒光PCR檢測試劑

有效

• 申請號: 201610145803.5
• 申請日: 2016-03-15
• 公開（公告）號: CN105671204B
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發明（設計）人: 陳靜;徐聰;張向東;王苗利;楊鵬;馬慧玲;王貴升;孫圣福;張月;孔祥華;于青海;李玉杰;徐鴻;劉麗平;藺曉月
• 申請（專利權）人: 山東省動物疫病預防與控制中心;北京森康生物技術開發有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 張菡

本發明涉及一種NDV/H9?AIV/IBV三重熒光PCR檢測試劑，屬于動物檢疫技術領域。本發明分別選擇新城疫病毒M基因編碼區特定序列、禽流感病毒H9亞型H基因編碼區特定序列、雞傳染性支氣管炎病毒M基因編碼區特定序列作為靶區域，在多重序列比對的基礎上，進引物和探針設計。引物長度為20個堿基左右，GC含量為50%?60%，引物內無二級結構和重復性，引物間和引物內無互補序列，引物間的熔解溫度（Tm值）相差小于5℃。為保證新城疫病毒探針的通用，探針的長度僅為13個堿基，采用LAN修飾，以提高其Tm值；其它兩種病毒探針的長度在25個堿基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。

技術領域

本發明涉及一種新城疫病毒/禽流感病毒H9亞型/傳染性支氣管炎病毒三重熒光定量RT-PCR檢測試劑及檢測方法，屬于動物檢疫技術領域。

背景技術

新城疫、禽流感和雞傳染性支氣管炎是危害養禽業的重要傳染病，屬于急性高度接觸性呼吸道傳染病。新城疫是納入養禽場日常免疫程序的防控傳染病，雖然疫苗覆蓋范圍廣，但是由于種種原因，新城疫疫情時常發生，只不過死亡率比不用疫苗來說大幅降低。禽流感H9亞型對養禽業的影響較大，疫苗使用較普遍，但是由于禽流感H9亞型毒株變異快，經常出現新的變異株，導致禽類發病。雞傳染性支氣管炎也具有很強的變異性，常規疫苗保護率不高，禽群感染發病的情況時有發生。在雞場使用疫苗的前提下，這三種傳染病發生導致雞的死亡率一般都在30%以內，由于這三種傳染病都屬于呼吸道傳染病，臨床癥狀相似，僅憑肉眼很難區分。再者臨床上經常出現兩種傳染病混合感染情況，給疫病的診斷帶來困難。

實驗室傳統的診斷新城疫、禽流感和雞傳染性支氣管炎的方法為雞胚病毒分離鑒定，該方法耗時長，需要在一定安全級別的實驗室內進行。當出現兩種以上傳染病混合感染時，雞胚病毒分離鑒定更為困難，一種病毒的增殖會掩蓋另一種病毒的增殖，最后往往只能鑒定出一種病毒，忽略了其它病毒的存在，造成發生疾病的誤診，給防治工作帶來難度。

隨著分子生物學技術的發展，一批核酸檢測技術如普通RT-PCR和熒光RT-PCR應用到新城疫病毒、禽流感病毒H9亞型和雞傳染性支氣管炎檢測診斷工作中，特別是熒光RT-PCR技術以敏感、特異、耗時短受到廣大科研和檢測技術人員的青睞，對于混合感染的禽群，也很容易用該方法檢出，真正做到了早發現、早確診。國內外報道單一熒光RT-PCR方法較多，將新城疫病毒、禽流感病毒H9亞型和雞傳染性支氣管炎病毒同時檢測的三重熒光RT-PCR技術還未見報道。

發明內容

本發明的目的是建立同時檢測新城疫病毒、禽流感病毒H9亞型和雞傳染性支氣管炎病毒的三重熒光RT-PCR檢測方法，為快速鑒別這三種病毒提供技術支撐。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種新城疫病毒/禽流感病毒H9亞型/傳染性支氣管炎病毒三重熒光定量RT-PCR檢測試劑，含有以下引物：

NDV-F：5’TATGRTGRTAACWTGCAAGAAGAG3’，如SEQ ID NO.1所示，

NDV-R為：5’GCTTTCACRTGCTTVACTG3’，如SEQ ID NO.2所示，

NDV-P：5’FAM -TA+G TG+C AG+G CA+C C-TAMRA 3’，如SEQ ID NO.3所示，

H9-F：5’ATGGGGTTTGCTGCC 3’ ，如SEQ ID NO.4所示，

H9-R：5’AATTATATACAAATGTTGCAYCTG 3’，如SEQ ID NO.5所示，

H9-P：5’ HEX- TTCTGGGCYATGTCYAAYGG-BHQ1-3’，如SEQ ID NO.6所示，

IBV-F：5’CTATCGCCAGGGAAATGTC3’，如SEQ ID NO.7所示，