[發明專利]NDV/H9-AIV/IBV三重熒光PCR檢測試劑

有效

• 申請號: 201610145803.5
• 申請日: 2016-03-15
• 公開（公告）號: CN105671204B
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發明（設計）人: 陳靜;徐聰;張向東;王苗利;楊鵬;馬慧玲;王貴升;孫圣福;張月;孔祥華;于青海;李玉杰;徐鴻;劉麗平;藺曉月
• 申請（專利權）人: 山東省動物疫病預防與控制中心;北京森康生物技術開發有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 張菡

1.一種新城疫病毒/禽流感病毒H9亞型/傳染性支氣管炎病毒三重熒光定量RT-PCR檢測試劑，其特征在于，含有以下引物：

NDV-F：5’TATGRTGRTAACWTGCAAGAAGAG3’，

NDV-R：5’GCTTTCACRTGCTTVACTG3’，

NDV-P：5’FAM-TA+G TG+C AG+G CA+C C-TAMRA-3’，

H9-F：5’ATGGGGTTTGCTGCC3’，

H9-R：5’AATTATATACAAATGTTGCAYCTG3’，

H9-P：5’HEX-TTCTGGGCYATGTCYAAYGG-BHQ1-3’，

IBV-F：5’CTATCGCCAGGGAAATGTC3’，

IBV-R：5’GCGTCCTAGTGCTGTACCC3’，

IBV-P：5’CY5-CCTGGAAACGAACGGTAGACCCT-BHQ2-3’，

其中，NDV-P：5’FAM-TA+G TG+C AG+G CA+C C-TAMRA-3’中“+”后面的堿基代表LNA修飾。

2.根據權利要求1所述的三重熒光定量RT-PCR檢測試劑，其特征在于，由熒光RT-PCR反應液和酶混合物按照20:1的體積比組成；

所述熒光RT-PCR反應液的組成：

10μmol/L的NDV-F：1μL，

10μmol/L的NDV-R：1μL，

10μmol/L的NDV-P：0.5μL，

10μmol/L的H9-F：1.2μL，

10μmol/L的H9-R：1.2μL，

10μmol/L的H9-P：1μL，

10μmol/L的IBV-F：1μL，

10μmol/L的IBV-R：1μL，

10μmol/L的IBV-P：0.5μL，

5×RT緩沖液：3.75μL，

10×PCR緩沖液：1.875μL，

25mmol/L的MgCl₂：2.125μL，

10mmol/L的dNTP：2μL，

DEPC處理水：1.85μL；

所述酶混合物：由200U/μL的M-MLV反轉錄酶、5U/μL的Taq DNA聚合酶、40U/μL的RNA酶抑制劑按2:1:1的體積比混合而成。

3.一種含有權利要求1所述三重熒光定量RT-PCR檢測試劑的試劑盒。

4.一種含有權利要求2所述三重熒光定量RT-PCR檢測試劑的試劑盒。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還含有陰性對照、陽性對照；

所述陰性對照：正常SPF雞的肝臟，用0.01mol/L pH7.2 PBS緩沖鹽水制成20％懸液，70℃作用1小時；

所述陽性對照：為滅活的新城疫病毒Lasota株、禽流感病毒H9N2、雞傳染性支氣管炎病毒H52株尿囊液分別1:1000倍稀釋后按1:1:1體積比混合而成。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，由提取試劑盒和檢測試劑盒組成：

所述提取試劑盒的組成如下：

組成	量
Buffer A	25mL×1瓶
Buffer B	60mL×1瓶
Buffer C	1250μL×2管
RNase-Free吸附柱和收集管	50套

Buffer A為裂解液，含有4mol/L異硫氰酸胍、10wt％十二烷基肌氨酸鈉、4.5wt％氯化鈉、30％乙醇v/v；

Buffer B為洗液，含有10mmol/L Tris-HCI、1mmol/LEDTA、70％乙醇v/v；

Buffer C為溶解液，為DEPC處理水；

所述檢測試劑盒的組成如下：

熒光RT-PCR反應液	1000μL×1管
酶混合物	50μL×1管
DEPC處理水	1mL×1管
陽性對照	1mL×1管
陰性對照	1mL×1管

。