[發明專利]一種單循環復制艾滋病毒樣顆粒及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201610145760.0
• 申請日: 2016-03-15
• 公開（公告）號: CN105754962A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 姚小劍;姚小剛;敖竹君;歐陽清檢
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C07K16/10;A61K39/21;A61K49/00;A61P31/18
• 代理公司: 深圳市興科達知識產權代理有限公司 44260
• 代理人: 王翀

技術領域

本發明屬于病毒樣顆粒技術領域，具體的說，涉及一種單循環復制艾滋病毒樣顆粒及其制備方法和應用。

背景技術

獲得性免疫缺陷綜合癥(艾滋病)是一種由HIV-1感染導致的，免疫及神經系統的退行性疾病，這種感染性疾病已經威脅到世界的生存，福利和社會穩定。HIV流行病學的全球估計表明，在2012年，世界范圍內已經有3530萬HIV-1攜帶者，且當年就有230萬新增病例。即使抗HIV-1化學療法領域在過去的幾十年內有了顯著的進步，由于病毒逃逸株和耐藥性的迅速出現，有效地防止HIV-1的感染仍然是最重要的挑戰之一。因此發展新型抗HIV的方法和更好地理解潛伏HIV復制的機制，在HIV研究領域仍然是一個迫切的任務。

為了更好地發展和學習不同的抗HIV的策略，鑒于HIV-1是一種高致病性病原體，其深入研究需要在三級實驗室進行分析。此外，為了評價多種新型抗HIV治療方法，一個很重要的步驟是臨床試驗之前，在動物模型中測試其抗病毒效果。這種對生物安全水平的高要求限制了許多研究團隊在這個特定的領域開展工作。除了體外研究，HIV研究也需要動物模型。直到現在，有兩種動物模型:非人靈長類(猴子或猩猩)模型和人化鼠模型已經被用于研究HIV/SIV感染和發病機理。雖然猴子模型對于評估SIV/SHIV感染和檢測一些抗HIV候選藥物非常有用，但它的使用有很多限制。例如使用SIV或SHIV代替HIV并不適合一些特異性攻擊HIV的策略。另外，在猴子模型中，不可能檢測在HIV感染人群中基因差異和耐藥性病毒。另一種動物模型，人化鼠模型能夠克服這些限制。在這個模型里面，人化鼠對人類艾滋病病毒易感，而且這些動物比非人靈長類更容易處理。現在，更多實質性的改進已經被用在新一代的人化鼠模型上。許多團隊已經證明這些人化鼠作為改進模型在研究HIV-1感染和CD4+T細胞損耗的功效。然而，由于HIV-1病毒的高致病性，所以在研究各類抗HIV策略時所需的防范設施要達到生物安全級別3(BSL-3)，而上述在人化鼠身上實驗HIV感染同樣需要在三級生物安全實驗室里進行，很多科研團隊為與HIV抗爭做出了巨大的貢獻，但因為需要高級別的安全設施，所以限制了他們繼續深入研究。

發明內容

為解決以上技術問題，本發明的目的在于提供本發明一種單循環復制艾滋病毒樣顆粒及其制備方法，得到的單循環復制艾滋病毒樣顆粒具有具有高敏感性、高安全性，并能適用于沒有三級實驗室密閉環境的不同實驗室。

本發明目的是這樣實現的：一種單循環復制艾滋病毒樣顆粒，其關鍵在于：由一個多基因缺失的HIV前病毒質粒、一個CMV-Gag/Pol表達質粒、一個Env表達質粒共轉染細胞后分離篩選獲得；所述多基因缺失的HIV前病毒質粒通過Gaussia螢光素酶基因序列替代nef基因序列進行標記后具有序列表中SEQIDNO.1所述的堿基序列。

優選地，上述CMV-Gag/Pol表達質粒表達的蛋白含有病毒殼蛋白、逆轉錄酶和聚合酶。

優選地，上述CMV-Gag/Pol表達質粒具有序列表中SEQIDNO.2所述的堿基序列。

優選地，上述Env表達質粒具有序列表中SEQIDNO.3所述的堿基序列。

一種單循環復制艾滋病毒樣顆粒的制備方法，其關鍵在于按以下步驟進行：將多基因缺失的HIV前病毒質粒、CMV-Gag/Pol表達質粒和Env表達質粒共轉染進離體人類細胞，分離復制后，對細胞液進行超速離心，在細胞上清液中收集得到單循環復制艾滋病毒樣顆粒，即C-ΔRI/ΔE/Gluc。

優選地，上述離體人類細胞為293T細胞、293細胞、cos-7細胞、BHK細胞、NIH3T3細胞或Hela細胞或各種CD4+T細胞系。

一種單循環復制艾滋病毒樣顆粒在制備以免疫動物生產診斷和治療單克隆抗體的應用。

一種單循環復制艾滋病毒樣顆粒在制備作為樹突狀細胞的靶向疫苗中的應用。

一種單循環復制艾滋病毒樣顆粒在各種CD4+T細胞系包括人原代CD4+T細胞、人原代單核細胞、巨噬細胞體外感染研究中作為感染源的應用。

優選地，上述病毒樣顆粒用于各種CD4+細胞系包括人原代CD4+T細胞、人原代單核細胞、巨噬細胞移植的裸鼠的感染研究中的作為感染源的應用，包括作為感染源用于檢測各種疫苗，抗病毒藥物或中和抗體體內有效性研究的質量檢測。

有益效果：