[發明專利]一種高活力漆酶液的制備方法

有效

• 申請號: 201610143931.6
• 申請日: 2016-03-14
• 公開（公告）號: CN105647881B
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 李松;湯斌;唐海;陳阿娜;劉宇;楊倩
• 申請（專利權）人: 安徽工程大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12R1/645
• 代理公司: 北京風雅頌專利代理有限公司 11403
• 代理人: 楊紅梅

本發明公開了一種高活力漆酶液的制備方法，包括如下步驟：步驟一，使用固體斜面活化栓菌以制備斜面種子；步驟二，將斜面種子在種子培養基中接種培養以制備種子培養液；步驟三，將種子培養液在發酵培養基中進行發酵產漆酶。所獲高活力漆酶液的發酵制備工藝簡單、穩定，具有周期短、重復性好等特點，所生產的漆酶液可以被應用與生物質能源、紡織、食品、生物修復、造紙等方面。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種高活力漆酶液的制備方法。

背景技術

栓菌屬微生物，屬于擔子菌門的白腐真菌(white-rot fungi)。白腐真菌靠降解木質素—纖維素材料的能力穿入木質，侵入木質細胞腔內，釋放降解性酶，導致木質腐爛并呈白色，是降解芳香化合物能力最強的微生物。

漆酶(EC 1.10.3.2)，屬于藍多銅氧化酶(blue multicopper oxidases,MCOs)家族的一種，能夠在氧氣作為電子受體的條件下氧化芳香族化合物，且底物作用特異性低。漆酶不僅可以氧化多酚類芳香族化合物，還可以利用在小分子介體的介導下形成的漆酶/介體體系(LMS)氧化非酚類物質或其它更為復雜的大分子。漆酶可選擇性的去除木質纖維素中的木質素，有效地對偶氮染料進行脫色，還可以去除環境中酚類藥物或其它類似毒性物質。因此，漆酶在生物質能源、紡織、造紙、廢報紙脫墨、食品、生物修復和生物傳感器等領域具有重要的研究和應用價值。

漆酶廣泛存在于木腐真菌中，并在植物、真菌、細菌和昆蟲等物種中也有發現。研究指出高等真菌，尤其是擔子菌門的白腐真菌，是目前最主要的漆酶生產菌種。白腐真菌主要利用分泌出的過氧化物酶(LiPs、MnPs和漆酶)對木質素進行催化氧化反應，從而降解木質素分子。與其它兩種木質素降解酶LiPs和MnPs相比，漆酶是目前唯一一個實現工業化生產和應用的木質素降解酶。白腐真菌的產酶水平一般在幾個至幾十個單位每毫升之間不等，極少能夠達到100U/mL以上，且發酵時間通常在兩周左右，甚至達到一個月之久，使得產酶水平低和產酶周期長成為目前限制漆酶工業化生產和應用的主要瓶頸問題。

由于搖瓶發酵與工業大生產發酵在發酵級別和發酵工藝方面存在巨大差異，因此工業酶制劑在研發到生產的歷程中，必須經歷一個實驗室逐級放大發酵的過程。小型發酵罐內發酵工藝參數的獲得可為酶發酵的工業放大提供基本參考數據和時間基礎，在酶的工業化生產中具有極其重要的地位。

發明內容

根據以上現有技術的不足，本發明所要解決的技術問題是提出一種高活力漆酶液的制備方法，目的是得到較高活力的漆酶液，所生產的漆酶液可以被應用與生物質能源、紡織、食品、生物修復、造紙等方面。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：

一種高活力漆酶液的制備方法，包括如下步驟：

步驟一，使用固體斜面活化栓菌以制備斜面種子；

步驟二，將斜面種子在種子培養基中接種培養以制備種子培養液；

步驟三，將種子培養液在發酵培養基中進行發酵產漆酶。

所述栓菌保藏編號為：CCTCC NO：M2015191，拉丁文名稱為Trametes sp.LS-10C，保藏單位為中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2015年04月03日，保藏地址為中國武漢武漢大學。

斜面種子的具體制備方法為：將該栓菌的超低溫(-80℃)甘油凍結管保藏管取出，在10～25℃溫度下緩慢回溫并溶解，使用無菌接種環挑取含有栓菌菌絲的保藏液體并劃線固體斜面培養基(500mL茄子瓶裝斜面培養基100mL)，置于30℃恒溫培養箱內培養3～5d，使栓菌菌絲長度達到5～10mm，即可作為斜面種子使用。

每L斜面培養基含有：土豆浸出汁20mL(取200g土豆去皮加入800mL水，煮沸0.5h，冷卻后定容到1000mL)，葡萄糖20g，瓊脂粉20g，pH為6.0。