[發明專利]一種短桿菌及從短桿菌發酵液中分離提純延胡索酸酶的方法

在審

• 申請號: 201610143796.5
• 申請日: 2016-03-14
• 公開（公告）號: CN105647834A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 胡永紅;曹翠翠;楊文革;曹洋;吳剛;王春曉;章泳
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/88;C12R1/13
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;袁正英

技術領域：

本發明涉及一種短桿菌及從短桿菌發酵液中分離提純延胡索酸酶的方法。

背景技術：

延胡索酸酶(Fumarase)又名蘋果酸裂合酶、延胡索酸水化酶或富馬酸酶， 氧化還原酶(E.C.4.2.1.2),是三羧酸循環(TCA循環)中的一個關鍵性酶，能 催化延胡索酸通過加水生成產率和光學純度都非常高的L-蘋果酸，且反應機制 較為單一，是一種非常具有商業價值的酶。工業生產中酶一般以粗酶的形式，然 而一定純度的酶不僅能夠提高催化效率，降低能耗，同時減少因雜酶的影響而產 生的副產物，影響產品純度。

常見的延胡索酸酶蛋白純化方法有鹽析沉淀法、疏水層析、離子交換層析和 凝膠過濾等。但傳統方法分離回收率低，樣品處理少，雜質多，產品純度低。

發明內容：

本發明的目的是提供一種短桿菌，本發明的另一目的是針對現有技術提取延 胡索酸酶純度低、回收率低的問題的問題，而提供了一種簡單易行，成本低，純 度低，易于大規模生產的一種從短桿菌發酵液中分離提純延胡索酸酶的方法。

本發明的技術方案為：一種短桿菌，菌種的拉丁學名是Brevibacteriumsp.， 參據的微生物：NJWGY2133，保藏日期為2008年5月26日，保藏中心登記入 冊編號為CGMCCNo.2520。

本發明還提供了從上述的短桿菌的發酵液中分離提純延胡索酸酶的方法，具 體步驟如下：

(1)發酵培養：將短桿菌菌株接種于肉湯瓊脂培養基后培養；挑取1環單菌落 接種至種子培養基，控制裝體積液量15％～25％，溫度28～37℃，轉速180～220rpm， 置于搖床中培養20～28h得種子液；以2％～10％的體積接種量接種于發酵產酶培 養基中，發酵罐體積裝液量為20～40％，控制溫度為25～37℃，攪拌速率220～400 rpm，pH控制在7.0～7.5，培養24～32h得發酵液；

(2)粗酶液的制備：將步驟(1)所得短桿菌發酵液離心，過濾制得菌絲體；將 菌體細胞加入去離子水中，制得質量濃度為35～45％的細胞懸浮液；用KQ-1001 型超聲機超聲破碎，得含有延胡索酸酶的混合物；

(3)雙水相萃取劑的制備：向無機鹽水溶液中添加聚乙二醇，并不斷攪拌混合 均勻，制得聚乙二醇-無機鹽雙水相體系溶液；其中雙水相體系中無機鹽的質量 百分比為5～15％，聚乙二醇的質量百分比為15～20％；

(4)雙水相萃?。簩⒉襟E(2)得到的粗酶液調節pH至8.0～8.5，加入步驟(3) 中聚乙二醇-無機鹽雙水相體系溶液，雙水相體系溶液與粗酶液的體積比為1： (1.5～2.0)，震蕩萃取；靜止待分層后，分別得無機鹽下相溶液和含有延胡索酸 酶的聚乙二醇上相溶液；

(5)二次萃?。簩⒉襟E(4)制得的聚乙二醇上相溶液調節pH至6.5～7.0，加入 無機鹽，使無機鹽在總體系中的質量百分比為2～4％；震蕩萃取，靜止待分層后， 分別得含有延胡索酸酶的無機鹽下相溶液和聚乙二醇上相溶液；

(6)將步驟(5)制得的含有延胡索酸酶的無機鹽下相溶液，透析除鹽，冷凍干 燥，制得延胡索酸酶。

優選步驟(1)中種子培養基組分為：葡萄糖15～20g/L，酵母浸粉1.0～5.0g/L， 玉米漿20～35g/L，MgSO₄·7H₂O0.3～0.7g/L，控制pH7.0～7.5；

優選步驟(1)中發酵培養基包括下述組分：葡萄糖15～20g/L，酵母浸粉 1.0～5.0g/L，玉米漿20～35g/L，MgSO₄·7H₂O0.3～0.7g/L，氯化鈉2～5g/L，KH₂PO₄2～4g/L。

優選步驟(2)中離心轉速為6000～8000r/min，離心時間為15～25min。

優選步驟(3)、(4)和(5)中的聚乙二醇分子量均為1000、1500或2000 任意一種；無機鹽選自硫酸鎂、硫酸鈉、硫酸銨、磷酸氫二鈉或磷酸氫二鉀任意 一種。

優選步驟(4)和(5)中的靜置分相時間均為20～40min。

優選步驟(6)中透析選用分子量8000～10000Da的透析袋。

上述將短桿菌菌株接種于肉湯瓊脂培養基培養采用常規方法培養。

本發明中延胡索酸酶的活力測定方法為：