[發明專利]一種短桿菌及從短桿菌發酵液中分離提純延胡索酸酶的方法

在審

• 申請號: 201610143796.5
• 申請日: 2016-03-14
• 公開（公告）號: CN105647834A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 胡永紅;曹翠翠;楊文革;曹洋;吳剛;王春曉;章泳
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/88;C12R1/13
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;袁正英

1.一種短桿菌，菌種的拉丁學名是Brevibacteriumsp.，參據的微生物：

NJWGY2133，保藏日期為2008年5月26日，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No.2520。

2.一種從如權利要求1所述的短桿菌的發酵液中分離提純延胡索酸酶的方法， 具體步驟如下：

(1)發酵培養：將短桿菌菌株接種于肉湯瓊脂培養基后培養；挑取1環單菌落 接種至種子培養基，控制體積裝液量15％～25％，溫度28～37℃，轉速180～220rpm， 置于搖床中培養20～28h得種子液；以2％～10％的體積接種量接種于發酵產酶培 養基中，發酵罐體積裝液量為20～40％，控制溫度為25～37℃，攪拌速率220～400 rpm，pH控制在7.0～7.5，培養24～32h得發酵液；

(2)粗酶液的制備：將步驟(1)所得短桿菌發酵液離心，過濾制得菌絲體；將 菌體細胞加入去離子水中，制得質量濃度為35～45％的細胞懸浮液；用KQ-1001 型超聲機超聲破碎，得含有延胡索酸酶的混合物；

(3)雙水相萃取劑的制備：向無機鹽水溶液中添加聚乙二醇，并不斷攪拌混合 均勻，制得聚乙二醇-無機鹽雙水相體系溶液；其中雙水相體系中無機鹽的質量 百分比為5～15％，聚乙二醇的質量百分比為15～20％；

(4)雙水相萃取：將步驟(2)得到的粗酶液調節pH至8.0～8.5，加入步驟(3) 中聚乙二醇-無機鹽雙水相體系溶液，雙水相體系溶液與粗酶液的體積比為1： (1.5～2.0)，震蕩萃取；靜止待分層后，分別得無機鹽下相溶液和含有延胡索酸 酶的聚乙二醇上相溶液；

(5)二次萃取：將步驟(4)制得的聚乙二醇上相溶液調節pH至6.5～7.0，加入 無機鹽，使無機鹽在總體系中的質量百分比為2～4％；震蕩萃取，靜止待分層后， 分別得含有延胡索酸酶的無機鹽下相溶液和聚乙二醇上相溶液；

(6)將步驟(5)制得的含有延胡索酸酶的無機鹽下相溶液，透析除鹽，冷凍干 燥，制得延胡索酸酶。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中種子培養基組分為： 葡萄糖15～20g/L，酵母浸粉1.0～5.0g/L，玉米漿20～35g/L，MgSO₄·7H₂O0.3～0.7 g/L，控制pH7.0～7.5。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中發酵培養基包括下 述組分：葡萄糖15～20g/L，酵母浸粉1.0～5.0g/L，玉米漿20～35g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3～0.7g/L，氯化鈉2～5g/L，KH₂PO₄2～4g/L。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中離心轉速為6000～8000 r/min，離心時間為15～25min。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)、(4)和(5)中的聚乙 二醇分子量均為1000、1500或2000任意一種；無機鹽選自硫酸鎂、硫酸鈉、硫 酸銨、磷酸氫二鈉或磷酸氫二鉀任意一種。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(4)和(5)中的靜置分相 時間均為20～40min。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(6)中透析選用分子量 8000～10000Da的透析袋。