[發明專利]用于測定大豆疫霉菌無毒基因Avr3a對鑒別寄主L83-570致病性的分子方法

有效

• 申請號: 201610143784.2
• 申請日: 2016-03-14
• 公開（公告）號: CN105671173B
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 崔林開;胡艷紅;周洲;李永麗;鄭偉
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 張燕

1.用于測定大豆疫霉菌無毒基因Avr3a對鑒別寄主L83-570致病性的分子方法，其特征在于：采用CTAB法提取待檢測大豆疫霉菌的基因組DNA；然后設計一對特異性引物AVR3A1F/AVR3A1R，所述的一對特異性引物AVR3A1F/AVR3A1R的堿基序列分別為：

AVR3A1F：5ˊ-ATCGAAGCCATATATCTACAGG-3ˊ；

AVR3A1R：5ˊ-CCTACTGTATGCAAAGTGATCG-3ˊ；

以提取的基因組DNA為模版進行PCR擴增，所述的一對特異性引物AVR3A1F/AVR3A1R分別結合在無毒基因Avr3a的上游和下游，從而使PCR擴增出的DNA片段包括完整的無毒基因Avr3a；用限制性內切酶BmgBI酶切擴增出的DNA片段，得到酶切產物；對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，得到酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；觀察酶切產物瓊脂糖凝膠電泳圖，如果在250bp-500bp范圍內有2條DNA條帶，則對應的待檢測大豆疫霉菌菌株對鑒別寄主L83-570表現為不致病；如果酶切后在750bp以下有1條DNA條帶，則對應的待檢測大豆疫霉菌菌株對鑒別寄主L83-570表現為致病。

2.根據權利要求1所述的用于測定大豆疫霉菌無毒基因Avr3a對鑒別寄主L83-570致病性的分子方法，其特征在于：所述CTAB法提取待檢測大豆疫霉菌基因組DNA的具體步驟為：

（1）從培養5-7天的待檢測大豆疫霉菌菌落邊緣切取10-20塊直徑2×2mm菌絲塊，移入裝有100mL澄清的10% V8液體培養基的三角瓶中，置于25℃黑暗條件下、120 r/min震蕩培養5-7天，培養好的菌絲體用滅菌雙層紗布過濾收集，蒸餾水沖洗1次，經冷凍干燥后充分搗碎成菌絲粉；所述的10% V8液體培養基指用蒸餾水稀釋10倍的美國Campbell公司生產的V8蔬菜汁；

（2）取50mg的菌絲粉于1.5ml EP管中，加入900μL質量濃度為2%的CTAB提取液和90μL質量濃度為10%的SDS水溶液后漩渦混合器上充分混勻；

（3）55-60℃水浴1h,每15min振蕩混勻一次；

（4）12000 r/min離心10min，取上清液A，加入苯酚、氯仿和異戊醇三者的混合物抽提1次，所加入的苯酚、氯仿和異戊醇三者的混合物中苯酚、氯仿和異戊醇的重量比為25:24:1，苯酚、氯仿和異戊醇三者混合物的體積與上清液A的體積相等；

（5）12000 r/min離心10min，吸取上清液B，加入氯仿抽提1次，所加入氯仿的體積與上清液B的體積相等；

（6）12000 r/min離心10min，吸取上清液C，加入3mol/L的NaAc水溶液和冰無水乙醇過夜沉淀基因組DNA，所加入NaAc水溶液和冰無水乙醇與上清液C的體積比為0.1:2:1；

（7）用預冷的體積比為70%的乙醇水溶液洗滌兩次，然后置于37℃條件下干燥；

（8）干燥后的DNA用100μL含50μg/mL核糖核酸酶的ddH₂O溶解，37℃靜置1h后，置于-20℃冰箱中備用。

3.根據權利要求1所述的用于測定大豆疫霉菌無毒基因Avr3a對鑒別寄主L83-570致病性的分子方法，其特征在于：所述PCR擴增的擴增體系和擴增條件分別為：

擴增體系：稀釋10倍的PCR反應緩沖液，2.5μL；2.5mmol/L的MgCl₂，1.5μL；2.5mmol/L的dNTPs，0.5μL；5U/μL的Taq DNA聚合酶，0.2μL；10μmol/L的特異性引物AVR3A1F和AVR3A1R各0.5μL；模板DNA，0.5μL；加無菌超純水至25μL；

擴增條件：95℃變性30S，60℃退火30S，72℃延伸30S，30個循環，72℃延伸5min。