[發(fā)明專利]用于測定大豆疫霉菌無毒基因Avr3a對鑒別寄主L83-570致病性的分子方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201610143784.2 | 申請日： | 2016-03-14 |
| 公開（公告）號： | CN105671173B | 公開（公告）日： | 2019-04-05 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 崔林開;胡艷紅;周洲;李永麗;鄭偉 | 申請（專利權(quán)）人： | 河南科技大學(xué) |
| 主分類號： | C12Q1/6895 | 分類號： | C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645 |
| 代理公司： | 洛陽公信知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙) 41120 | 代理人： | 張燕 |
| 地址： | 471000 河*** | 國省代碼： | 河南;41 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 用于 測定 大豆 霉菌 無毒 基因 avr3a 鑒別 寄主 l83 570 致病性 分子 方法 | ||
1.用于測定大豆疫霉菌無毒基因
AVR3A1F：5ˊ-ATCGAAGCCATATATCTACAGG-3ˊ；
AVR3A1R：5ˊ-CCTACTGTATGCAAAGTGATCG-3ˊ；
以提取的基因組DNA為模版進行PCR擴增，所述的一對特異性引物AVR3A1F/AVR3A1R分別結(jié)合在無毒基因
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于測定大豆疫霉菌無毒基因
（1）從培養(yǎng)5-7天的待檢測大豆疫霉菌菌落邊緣切取10-20塊直徑2×2mm菌絲塊，移入裝有100mL澄清的10% V8液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于25℃黑暗條件下、120 r/min震蕩培養(yǎng)5-7天，培養(yǎng)好的菌絲體用滅菌雙層紗布過濾收集，蒸餾水沖洗1次，經(jīng)冷凍干燥后充分搗碎成菌絲粉；所述的10% V8液體培養(yǎng)基指用蒸餾水稀釋10倍的美國Campbell公司生產(chǎn)的V8蔬菜汁；
（2）取50mg的菌絲粉于1.5ml EP管中，加入900μL質(zhì)量濃度為2%的CTAB提取液和90μL質(zhì)量濃度為10%的SDS水溶液后漩渦混合器上充分混勻；
（3）55-60℃水浴1h,每15min振蕩混勻一次；
（4）12000 r/min離心10min，取上清液A，加入苯酚、氯仿和異戊醇三者的混合物抽提1次，所加入的苯酚、氯仿和異戊醇三者的混合物中苯酚、氯仿和異戊醇的重量比為25:24:1，苯酚、氯仿和異戊醇三者混合物的體積與上清液A的體積相等；
（5）12000 r/min離心10min，吸取上清液B，加入氯仿抽提1次，所加入氯仿的體積與上清液B的體積相等；
（6）12000 r/min離心10min，吸取上清液C，加入3mol/L的NaAc水溶液和冰無水乙醇過夜沉淀基因組DNA，所加入NaAc水溶液和冰無水乙醇與上清液C的體積比為0.1:2:1；
（7）用預(yù)冷的體積比為70%的乙醇水溶液洗滌兩次，然后置于37℃條件下干燥；
（8）干燥后的DNA用100μL含50μg/mL核糖核酸酶的ddH2O溶解，37℃靜置1h后，置于-20℃冰箱中備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于測定大豆疫霉菌無毒基因
擴增體系：稀釋10倍的PCR反應(yīng)緩沖液，2.5μL；2.5mmol/L的MgCl2，1.5μL；2.5mmol/L的dNTPs，0.5μL；5U/μL的Taq DNA聚合酶，0.2μL；10μmol/L的特異性引物AVR3A1F和AVR3A1R各0.5μL；模板DNA，0.5μL；加無菌超純水至25μL；
擴增條件：95℃變性30S，60℃退火30S，72℃延伸30S，30個循環(huán)，72℃延伸5min。
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