[發明專利]一種青蒿PDR亞家族轉運蛋白及其功能驗證方法和應用

有效

• 申請號: 201610141719.6
• 申請日: 2016-03-14
• 公開（公告）號: CN105585624B
• 公開（公告）日: 2019-02-19
• 發明（設計）人: 唐克軒;付雪晴;石璞;劉萌;陳明慧;馬亞男;郝小龍;黎凌;劉品;孫小芬
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/29;C12Q1/68;A01H5/00;A01H6/14
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發明公開了一種青蒿PDR亞家族轉運蛋白，該蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:2所示；或者該蛋白由在高嚴謹條件與編碼氨基酸序列為SEQ ID NO:2所示的蛋白質的核酸的互補鏈雜交的核酸編碼。進一步地，發明人將該蛋白命名為AaPDR1，為青蒿分泌型腺毛特異表達的轉運蛋白，酵母轉運實驗和青蒿中干擾該轉運蛋白證明AaPDR1參與青蒿中青蒿素合成途徑中間產物二氫青蒿酸的轉運。該發明對于為青蒿素的規模化生產提供高產、穩定新藥源具有重要意義。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種青蒿PDR亞家族轉運蛋白及其功能驗證方法和應用。

背景技術

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。其地上部分所提取的含有過氧橋的倍半萜內酯氧化物——青蒿素，是目前應用最廣泛，療效最好的抗瘧疾藥物，特別是對腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾更加有效。目前，青蒿素聯合療法(ACTs)是世界衛生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法。但其青蒿素在植物青蒿中的含量低，尚無法完全滿足全球的市場需求。青蒿具有分泌型腺毛(glandular trichomes)和非分泌型腺毛(nonglandulartrichomes)。在青蒿葉片的正面和背面、莖稈、花上都大量存在分泌型腺毛，這里是大量次生代謝物的累積場所，青蒿素也被認為儲存于此處。

ATP結合盒式(ATP binding cassette，ABC)轉運蛋白是一大類非常多樣化非常特殊的超級家族。大部分ABC轉運蛋白直接參與到各種分子的跨膜運輸。此轉運蛋白利用水解ATP釋放能量對細胞質內多種生物分子進行跨膜運輸，轉運底物包括：脂類、氨基酸、生物堿、萜類物質等。根據對于細胞質的轉運方向可以粗略分為攝取轉運蛋白(importer)和外排轉運蛋白(exporter)。ABC轉運蛋白的特征是具有ATP結合區域(ATP-bindingcassette)，也被稱為核酸結合區域(nucleotide-binding domain，NBD)，具有一些非常保守的模序(motif)，包括Walker A和Walker B序列、ABC signature motif、H loop和Qloop。植物中有大量的ABC轉運蛋白，近年來的研究表明植物ABC轉運蛋白不僅僅涉及到植物激素、酯類、金屬離子、次生代謝物、外源化學物質的轉運有關，而且對于植物和病原體互作以及離子通道的建成都有重要作用。多向耐藥性(pleiotropic drug resistance，PDR)轉運蛋白屬于ABC轉運蛋白家族G亞家族，包含反向的核酸結合區域-跨膜結合區域(NBD-TMD)類型的轉運蛋白。

發明內容

針對青蒿素在植物青蒿中的含量低，無法有效滿足市場需求的問題，發明人考慮到如果通過對青蒿分泌型腺毛轉錄組數據庫分析，篩選出參與青蒿素合成途徑相關轉運蛋白，并且驗證其功能，那么就可以利用基因工程手段提高轉運蛋白的轉運效率，從而提高青蒿中青蒿素的含量。AaPDR1是發明人從青蒿中克隆得到的一種ABC轉運蛋白，屬于青蒿PDR轉運蛋白亞家族，因此是一種青蒿PDR亞家族轉運蛋白，命名為AaPDR1。為了驗證AaPDR1的功能，發明人利用酵母突變體AD12345678體外轉運實驗證明AaPDR1是青蒿素直接前體物質二氫青蒿酸的從胞內到胞外的外排轉運蛋白。并且采用基因工程手段，將該AaPDR1轉運蛋白反義干擾載體轉化青蒿，可以顯著抑制青蒿素的合成。因此，克隆AaPDR1基因及其外排功能的研究對于提高青蒿素含量和生產代謝產物的基因工程育種具有重要意義。經對現有技術文獻的檢索發現，尚未發現有與本發明的AaPDR1基因序列相關的報道。

本發明提供一種青蒿PDR亞家族轉運蛋白，所述青蒿PDR亞家族轉運蛋白具有以下一種或者兩種特征：

1)所述青蒿PDR亞家族轉運蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或者所述青蒿PDR亞家族轉運蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

2)所述青蒿PDR亞家族轉運蛋白由在高嚴謹條件與編碼氨基酸序列為SEQ ID NO:2所示的蛋白質的核酸的互補鏈雜交的核酸編碼。