[發(fā)明專利]一種青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其功能驗(yàn)證方法和應(yīng)用有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201610141719.6 | 申請(qǐng)日： | 2016-03-14 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN105585624B | 公開（公告）日： | 2019-02-19 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 唐克軒;付雪晴;石璞;劉萌;陳明慧;馬亞男;郝小龍;黎凌;劉品;孫小芬 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 上海交通大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C07K14/415 | 分類號(hào)： | C07K14/415;C12N15/29;C12Q1/68;A01H5/00;A01H6/14 |
| 代理公司： | 上海旭誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31220 | 代理人： | 鄭立 |
| 地址： | 200240 *** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 青蒿 pdr 家族 轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白 及其 功能 驗(yàn)證 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能驗(yàn)證方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)從青蒿cDNA文庫中克隆到所述青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸序列SEQ ID NO:1所示，即AaPDR1基因；
(2)把AaPDR1基因可操作性地連接于酵母表達(dá)調(diào)控序列，形成含AaPDR1基因的酵母表達(dá)載體；
(3)將含所述AaPDR1基因的酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AD12345678，得到轉(zhuǎn)基因酵母菌，所述轉(zhuǎn)基因酵母菌獲得了二氫青蒿酸外排的功能，從而驗(yàn)證了所述青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有外排二氫青蒿酸的功能。
2.一種青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能驗(yàn)證方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)從青蒿cDNA文庫中克隆到所述青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸序列，如SEQ ID NO:1所示，即AaPDR1基因；
(2)把AaPDR1基因可操作性地連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成含AaPDR1基因的植物反義干擾表達(dá)載體；
(3)將含所述AaPDR1基因的植物反義干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EH105，獲得具有所述干擾表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；
(4)利用所述步驟3構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，經(jīng)卡那霉素篩選得到抗性苗，再經(jīng)PCR檢測(cè)為陽性的植株即為轉(zhuǎn)基因青蒿；
(5)對(duì)獲得的所述轉(zhuǎn)基因青蒿進(jìn)行青蒿素、二氫青蒿酸和青蒿酸含量測(cè)定，進(jìn)而獲得青蒿素合成受抑制的青蒿植株，從而驗(yàn)證了所述青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有影響青蒿素合成的功能。
3.一種青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能驗(yàn)證方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)從青蒿cDNA文庫中克隆到所述青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸序列，如SEQ ID NO:1所示，即AaPDR1基因；
(2)把AaPDR1基因可操作性地連接于酵母表達(dá)調(diào)控序列，形成含AaPDR1基因的酵母表達(dá)載體；
(3)將含所述AaPDR1基因的酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)入釀酒酵母AD12345678，得到轉(zhuǎn)基因酵母菌，所述轉(zhuǎn)基因酵母菌獲得了二氫青蒿酸外排的功能，從而驗(yàn)證了所述青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有外排二氫青蒿酸的功能；
(4)把AaPDR1基因可操作性地連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成含AaPDR1基因的植物反義干擾表達(dá)載體；
(5)將含所述AaPDR1基因的植物反義干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EH105，獲得具有所述干擾表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；
(6)利用所述步驟5構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，經(jīng)卡那霉素篩選得到抗性苗，再經(jīng)PCR檢測(cè)為陽性的植株即為轉(zhuǎn)基因青蒿；
(7)對(duì)獲得的所述轉(zhuǎn)基因青蒿進(jìn)行青蒿素、二氫青蒿酸和青蒿酸含量測(cè)定，進(jìn)而獲得青蒿素合成受抑制的青蒿植株，從而驗(yàn)證了所述青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有影響青蒿素合成的功能。
4.一種如權(quán)利要求2或3任一項(xiàng)所述的青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能驗(yàn)證方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EH105的具體方法是采用凍融法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
5.一種青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在提高青蒿素含量的青蒿育種中的應(yīng)用，其特征在于，所述青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有以下特征：所述青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
6.一種青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在制備抗瘧疾藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有以下特征：所述青蒿PDR亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
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