[發(fā)明專利]一種雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的自然殺傷細(xì)胞的制備方法及其試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610141303.4
• 申請(qǐng)日: 2016-03-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105647873A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳建勛;黃啟明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 紫程瑞生會(huì)（北京）生物技術(shù)發(fā)展有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/86;C12N15/62;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的自然殺傷細(xì)胞的制備 方法及其試劑盒，其中包括如下特征：構(gòu)建成含特異結(jié)合信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分 子家族成員7(SignalingLymphocyticActivationMoleculeFamily，Member7， SLAMF7)以及纖連蛋白變異體(fibronectinvariant，F(xiàn)Nv)的雙特異嵌合抗原受 體(doublechimericantigenreceptor，Di-CAR)基因重組到病毒載體上并轉(zhuǎn)染人 自然殺傷細(xì)胞(Naturalkillercells，NK)，高表達(dá)該雙特異性嵌合抗原受體基 因，可特異結(jié)合表達(dá)信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子家族成員7和纖連蛋白變異體的腫 瘤細(xì)胞，并抑制自然殺傷細(xì)胞抑制性受體表達(dá)，避免了腫瘤細(xì)胞免疫逃避；同 時(shí)激活第一信號(hào)和共刺激信號(hào)而引發(fā)抗腫瘤細(xì)胞毒性活性，體內(nèi)體外試驗(yàn)抗腫 瘤具有很強(qiáng)殺傷毒性；本發(fā)明還提供了一種含通過(guò)上述方法而得到的自體自然 殺傷細(xì)胞制備的試劑盒，可獲得高表達(dá)該雙特異性嵌合抗原受體基因并引發(fā)強(qiáng) 大的抗腫瘤效應(yīng)。

背景技術(shù)

自然殺傷細(xì)胞是目前在國(guó)內(nèi)進(jìn)行臨床治療常見(jiàn)的免疫細(xì)胞技術(shù)。目前NK 細(xì)胞主要通過(guò)滋養(yǎng)細(xì)胞或者抗體激活誘導(dǎo)作用獲得的，表達(dá)CD16+CD56+陽(yáng)性 細(xì)胞。其抗腫瘤主要機(jī)制為通過(guò)其表達(dá)激活性受體與腫瘤細(xì)胞膜上配體結(jié)合， 釋放顆粒酶和穿孔素直接殺死腫瘤細(xì)胞，以及高表達(dá)的CD16分子引發(fā)抗體依 賴性細(xì)胞毒性活性對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡作用。

然而，NK細(xì)胞在臨床上治療惡性腫瘤方面療效還有限，根據(jù)臨床治療數(shù) 據(jù)統(tǒng)計(jì)包括腫瘤完全消失的完全緩解和腫瘤部分縮減的部分緩解的有效率在 40-50％之間，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床治療惡性腫瘤的需要。影響NK細(xì)胞治療癌 癥的效果的關(guān)鍵問(wèn)題是NK細(xì)胞靶向腫瘤細(xì)胞殺傷特異性差，以及其表達(dá)抑制 性受體，使得腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)結(jié)合其產(chǎn)生免疫逃逸。目前提高NK細(xì)胞數(shù)量、 CD16+CD56+表型和降低抑制性受體表達(dá)，均已有研究開(kāi)展，以有效提高其治 療癌癥的有效率。

本發(fā)明提供了以結(jié)合腫瘤細(xì)胞特異表達(dá)的SLAMF7以及FNv的雙特異 嵌合抗原基因重組到病毒載體上并轉(zhuǎn)染人自然殺傷細(xì)胞，高表達(dá)該雙特異性嵌 合抗原受體基因，可特異結(jié)合表達(dá)信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子家族成員7和纖連蛋 白變異體的腫瘤細(xì)胞，如黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤和脈絡(luò)膜黑色素瘤等均特 異表達(dá)SLAMF7以及FNv兩個(gè)腫瘤抗原；并抑制自然殺傷細(xì)胞抑制性受體表 達(dá)，避免了腫瘤細(xì)胞免疫逃避；同時(shí)激活第一信號(hào)和共刺激信號(hào)而引發(fā)抗腫瘤 細(xì)胞毒性活性，體內(nèi)體外試驗(yàn)抗腫瘤具有很強(qiáng)殺傷毒性，將顯著提高臨床療效 和延長(zhǎng)患者生存期。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有臨床應(yīng)用NK細(xì)胞技術(shù)的不足，特別是因NK細(xì)胞靶向腫 瘤細(xì)胞殺傷特異性差；NK細(xì)胞表達(dá)抑制性受體，使得腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)結(jié)合 其產(chǎn)生免疫逃逸，以及在體內(nèi)激活患者自身免疫作用抗腫瘤不足，因而造成殺 瘤活性低和大多數(shù)惡性腫瘤治療有限。本發(fā)明在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)黑色素 瘤、葡萄膜黑色素瘤和脈絡(luò)膜黑色素瘤等均特異表達(dá)兩個(gè)腫瘤抗原SLAMF7 和FNv，根據(jù)這兩個(gè)腫瘤抗原的胞外區(qū)通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得與兩者特異性結(jié)合 反應(yīng)的單克隆細(xì)胞株和單克隆抗體，蛋白測(cè)序確定單克隆抗體的重鏈和輕鏈的 可變區(qū)，利用基因PCR技術(shù)將重鏈和輕鏈通過(guò)鏈接子(linker)連接產(chǎn)生單鏈 抗體(singlechainantibodyfragment，scFv)，在酶聯(lián)免疫法和細(xì)胞流式檢測(cè)該 兩個(gè)scFv能特異結(jié)合SLAMF7和FNv兩個(gè)腫瘤抗原，腫瘤細(xì)胞為黑色素瘤、 葡萄膜黑色素瘤和脈絡(luò)膜黑色素瘤等，這兩個(gè)scFv可以作為結(jié)合SLAMF7和 FNv兩個(gè)腫瘤抗原的抗體。