[發明專利]一種雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的自然殺傷細胞的制備方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 201610141303.4
• 申請日: 2016-03-14
• 公開（公告）號: CN105647873A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 陳建勛;黃啟明
• 申請（專利權）人: 紫程瑞生會（北京）生物技術發展有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/86;C12N15/62;A61K35/17;A61P35/00
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1.一種雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的自然殺傷細胞的制備方法，其 特征在于，構建成含特異結合信號淋巴細胞激活分子家族成員7(Signaling LymphocyticActivationMoleculeFamily，Member7，SLAMF7)以及纖連蛋白變 異體(fibronectinvariant，FNv)的雙特異性嵌合抗原受體(doublechimericantigen receptor，Di-CAR)基因重組到病毒載體上并轉染人自然殺傷細胞(Naturalkiller cells，NK)；

所述雙特異性嵌合抗原受體(Di-CAR)基因的cDNA構建在病毒載體中， 并轉染NK細胞，再將NK細胞培養到第21天，獲得Di-CAR-NK細胞；通過 熒光定量PCR技術檢測，轉染了Di-CAR病毒載體的NKs其表達Di-CAR基 因高于未轉染的NKs為50倍以上；

所獲得的自然殺傷細胞，高表達該雙特異性嵌合抗原受體基因，可特異結 合表達信號淋巴細胞激活分子家族成員7和纖連蛋白變異體的腫瘤細胞，并抑 制自然殺傷細胞抑制性受體表達，阻止了腫瘤細胞免疫逃避，同時激活第一信 號和共刺激信號而引發抗腫瘤細胞毒性活性，體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺 傷毒性；其高表達其特異標志物CD16+/CD56+，陽性率高于80％以上，激活 性受體陽性率超過80％以上，而抑制性受體陽性率低于10％以下。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述纖連蛋白變異體的特 異嵌合抗原受體基因，包括纖連蛋白變異體的單鏈抗體并鏈接了特異結合抑制 性受體基因啟動子的轉錄因子突變體(c-Myc突變體)的基因片段。

3.根據權利要求1-2任一項所述的方法，其特征在于，所述的含特異結合 信號淋巴細胞激活分子家族成員7的特異嵌合抗原受體基因，包括特異結合信 號淋巴細胞激活分子家族成員7的單鏈抗體并串聯了兩個共刺激分子胞內域 和CD3ζ胞內信號區的基因片段；所述兩個共刺激分子為CD28和CD137。

4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其特征在于，所述雙特異 性嵌合抗原受體基因之間鏈接了弗林蛋白酶切割位點，其在細胞內蛋白翻譯后 可產生兩個獨立發揮功能的嵌合抗原受體。

5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述自然殺 傷細胞來源于自體靜脈血、自體骨髓、臍帶血和胎盤血等的單個核細胞。