[發明專利]一種基于Ion ProtonTM測序平臺的血液游離DNA的文庫構建方法、試劑及其應用

在審

• 申請號: 201610139977.0
• 申請日: 2016-03-11
• 公開（公告）號: CN105695448A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 丁聰聰;丁志遠;葉佳芝;牟曉威;邱寶義;劉明明;陳賢豐
• 申請（專利權）人: 浙江圣庭生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C40B50/06;C40B40/06
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

技術領域

本發明涉及高通量測序領域，具體是一種基于IonProton^TM測序平臺的血液游離DNA的文庫構建方 法、試劑及其應用。

背景技術

據美國2006年的出生缺陷全球報告統計全球每年至少新增出生缺陷790萬例，占出生人口的6％，而 我國又是出生缺陷的高發國，目前出生缺陷發生率約5.6％，每年新增出生缺陷約90萬例。有報告顯示， 我國嚴重出生缺陷患兒中除30％經早期診斷治療可正常生活，約30％在出生后死亡，40％將成為終生殘疾， 不僅給家庭造成嚴重經濟負擔，同時也給家庭帶來嚴重的心理負擔和精神痛苦，此外給國家和社會的經濟 發展也造成了沉重的負擔。據統計，我國每年出生缺陷患兒的治療費用高達數百億元，維持基本的生活費 用高達數百億元，給國家帶來了約數千億元的間接費用。

出生缺陷是指嬰兒在出生之前，在母體子宮里就發生的發育異常以及存在于身體某些部位的畸形。這 些缺陷大多是由各種各樣的遺傳病引起的。遺傳病的種類大致可分為三類：單基因遺傳、多基因遺傳病、 染色體病。由于染色體病累及涉及的基因數目較多，故癥狀通常更嚴重。在眾多染色體異常疾病中，染色 體非整倍體導致的殘疾及生活障礙尤為明顯，是胎兒出生缺陷最常見病因之一。染色體非整倍體是指細胞 的染色體數目多或少了一條或多條。新生兒中染色體異常的發病率為1/160，臨床上常見的非整倍體有21- 三體綜合征(唐氏綜合征)、18-三體綜合征(愛德華氏綜合征)、13-三體綜合征(帕陶氏綜合征)，以及一些 性染色體畸變，例如X單體(Turner綜合征)，或性染色體三體，如47XXX(X三體綜合征)、47XXY (Klinefelter綜合征)、47XYY(XYY綜合征)，其中以21-三體綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征最 為常見，有研究顯示胎兒21三體和18三體發病率分別為1/800和1/6000，而13三體發病率為1/10000。 目前此類疾病沒有有效的治療方法，因此通過產前診斷胎兒是否患有遺傳缺陷病是減少畸形兒出生率最為 有效的方法之一。

相對于該類疾病的傳統的檢測方法，基于高通量測序技術的胎兒游離DNA檢測技術作為針對胎兒染 色體非整倍體產前篩查技術的優勢在于：第一，無創傷性，只需抽取母體外周血進行檢測，避免了有創性 取材方式帶來的污染、感染，及胎兒流產風險。第二，對于疾病有高的檢出率和低的假陽性率。該技術對 常見染色體非整倍體異?？倷z出率在99％以上，假陽性0.1％左右，大大優于傳統檢測方式。第三，適用 孕周范圍較大，孕12-24周都可接受無創產前DNA檢測，做產前診斷最佳穿刺抽取羊水時間是妊娠16-20 周，而無創產前基因檢測更是把時間提前到了12周，能夠更早的檢測出結果并做出相應對策。第四，臨 床所需信息少，操作較簡單，質量可以控制。

高通量測序技術又稱為下一代測序技術，第二代高通量IonProtonTM測序平臺具有測序通量高、準 確度高、成本低、操作簡便等優點，在基于IonProtonTM平臺進行高通量產前檢測的流程中，文庫的制備 是非常重要的一步，文庫質量的高低將直接影響測序質量的高低并對檢測結果產生影響。

現有技術中基于IonProtonTM平臺的文庫構建方法主要包括以下步驟：

(1)提取樣本DNA；

(2)將樣本DNA與末端修復試劑和末端修復酶混合進行反應；

(3)將步驟(2)所得到的DNA片段與連接酶、聚合酶、連接反應緩沖液、接頭、標簽接頭混合進 行反應；

(4)將步驟(3)所得到的反應產物進行磁珠篩選大小和純化得到DNA文庫；

(5)QPCR檢測文庫濃度，不同樣本進行等濃度混樣；

(6)將步驟(5)得到的文庫加入擴增酶Mix和擴增引物進行PCR擴增，再進行磁珠篩選大小和純 化得到游離DNA文庫；

(7)文庫檢測后進行高通量測序。