[發明專利]一種基于Ion ProtonTM測序平臺的血液游離DNA的文庫構建方法、試劑及其應用

在審

• 申請號: 201610139977.0
• 申請日: 2016-03-11
• 公開（公告）號: CN105695448A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 丁聰聰;丁志遠;葉佳芝;牟曉威;邱寶義;劉明明;陳賢豐
• 申請（專利權）人: 浙江圣庭生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C40B50/06;C40B40/06
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

1.一種基于IonProton^TM測序平臺的血液游離DNA文庫構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)血液游離DNA提取：采用磁珠法提取樣品中的血液游離DNA；

(2)末端修復：將步驟(1)所得到的DNA片段進行末端修復，得到平末端DNA；

(3)片段選擇：利用磁珠對步驟(2)所得到的平末端DNA進行片段大小篩選并進行磁珠純化；

(4)接頭連接：將步驟(3)所得到的DNA片段與接頭連接反應試劑、接頭、標簽接頭混合進行接 頭連接反應；

(5)磁珠純化：將步驟(4)所得到的反應產物利用磁珠進行純化；

(6)文庫擴增：將步驟(5)純化后的DNA片段加入擴增試劑和擴增引物進行PCR擴增，再利用磁 珠進行純化，得到血液游離DNA文庫；

(7)文庫檢測：將步驟(6)所得到的血液游離DNA文庫采用Qubit和AgilentBioanalyzer2100檢測 文庫濃度及文庫片段大小；

(8)高通量測序：基于IonProton^TM測序平臺，將步驟(7)中所得到的不同血液游離DNA文庫樣 本等濃度混樣進行高通量測序；

其中，步驟(1)所述樣品為孕12-24周的孕婦血漿；

步驟(1)采用試劑盒提取血液游離DNA，所述試劑盒為血清游離DNA提取試劑盒；

步驟(2)中進行末端修復時所用的末端修復試劑pH值為7.4-7.6，溶劑為水，溶質為：5-15mM的 Tris-HCl緩沖溶液、40-60mM的NaCl溶液、8-12mMMgCl₂、2-4mM二硫蘇糖醇、8-12mMATP、8-12mM dNTPs混合液，末端修復酶為8-12U/μl的EndRepair酶；

步驟(3)中所用磁珠為AgencourtAMPureXP磁珠；

步驟(4)中接頭連接反應試劑由酶與連接反應緩沖液組成，所述酶為300-500U/μl的T₄DNALigase 和6-10U/μl的NickRepairDNAPolymerase；連接反應緩沖液pH值為7.6，溶劑為水，溶質為：pH7.8-8.2、 40-60mM的Tris-HCl緩沖溶液、8-12mM的KCl、8-12mM二硫蘇糖醇、0.5-2mM的ATP、1-3nM的dNTPs 混合液、8-12mM的(NH₄)₂SO₄、1-3mM的MgSO₄；

步驟(5)中所用磁珠為AgencourtAMPureXP磁珠；

步驟(6)中擴增試劑pH值為7.5-7.7，溶劑為水，溶質為：1-3U/μlPCRSuperMixHigh Fidelity、pH8.8-9.0的64-68mM的Tris-SO₄、15-25mM的(NH₄)₂SO₄、1-3mM的MgSO₄、200-250μMdNTPs 混合液；

步驟(6)中所用磁珠為AgencourtAMPureXP磁珠。

2.根據權利要求1所述的基于IonProton^TM測序平臺的血液游離DNA文庫構建方法，其特征在于，步 驟(1)中的孕婦血漿取自孕婦外周血的血漿，將孕婦血漿4℃下1600g離心15min后，取上清于2ml離 心管中，4℃下16000g離心10min，將孕婦血漿轉移至新的離心管中，該孕婦血漿用于后續實驗或-80℃凍 存備用。

3.根據權利要求1所述的基于IonProton^TM測序平臺的血液游離DNA文庫構建方法，其特征在于，其 中步驟(3)篩選片段大小為200-300bp。