[發(fā)明專利]一種1;3-1;4-β-葡聚糖酶突變體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610139909.4
• 申請日: 2016-03-11
• 公開（公告）號(hào): CN105671022B
• 公開（公告）日: 2019-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李崎;鈕成拓;朱林江;王金晶;李永仙;鄭飛云;劉春鳳
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/42
• 分類號(hào): C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12C5/00;C12C7/04;A23K20/189;A23L29/00;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 耿曉岳

本發(fā)明公開了一種1,3?1,4?β?葡聚糖酶突變體，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明將特基拉芽孢桿菌(Bacillus terquilensis)CGX 5?1來源的1,3?1,4?β?葡聚糖酶的第40位的絲氨酸和43位的絲氨酸、46位的谷氨酸和205位的組氨酸通過迭代飽和突變的方法分別突變?yōu)楣劝彼帷⒐劝彼帷⒏彼岷透彼幔罱K獲得四株單突變體和三株復(fù)合突變體。七株突變酶均表現(xiàn)出了更好的熱穩(wěn)定性，尤其是S40E/S43E/E46P/H205P突變酶具有極佳的熱穩(wěn)定性。這些突變酶和野生酶相比更有利于其在工業(yè)上的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種1,3-1,4-β-葡聚糖酶突變體，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

β-葡聚糖是存在于禾本科植物細(xì)胞壁的一種非淀粉性多糖。其是由高達(dá)上千個(gè)β-D-葡萄糖殘基通過β-1,3或β-1,4糖苷鍵線狀排列而成，具有很高的分子量。其可以溶解于水中，形成的溶液黏度很高，這給啤酒行業(yè)及飼料行業(yè)帶來了諸多不利。在啤酒工業(yè)的主要原料麥芽中含有大量β-葡聚糖，在麥汁中β-葡聚糖未能及時(shí)降解會(huì)導(dǎo)致麥汁黏度過大，造成過濾困難，延長麥醪過濾時(shí)間，降低浸出物含量，對于成品啤酒會(huì)影響其非生物穩(wěn)定性。在純生啤酒的生產(chǎn)過程時(shí)，過多β-葡聚糖的存在會(huì)造成濾膜的膜孔堵塞，導(dǎo)致過濾能力下降。在飼料行業(yè)中，大麥和小麥等飼料中含有大量的β-葡聚糖。無論在人的腸道還是動(dòng)物的腸道內(nèi)都不能將β-葡聚糖直接消化吸收，其必須經(jīng)過酶降解后才能被利用，且β-葡聚糖會(huì)阻止飼料有效成分在動(dòng)物腸道中內(nèi)的吸收，降低了飼料中有效成分的轉(zhuǎn)化率，是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子。與此同時(shí)，β-葡聚糖為微生物特別是致病菌的寄居繁殖提供了豐富的營養(yǎng)，造成大量有害微生物在動(dòng)物腸道內(nèi)繁殖，引起畜禽腹瀉，同時(shí)會(huì)競爭性消耗大量物質(zhì)而降低飼料利用率。

來源于特基拉芽孢桿菌(Bacillus terquilensis)CGX 5-1的1,3-1,4-β-葡聚糖酶，簡稱β-葡聚糖酶。1,3-1,4-β-葡聚糖酶可以在3-O-吡喃葡萄糖位點(diǎn)專一性切割β-葡聚糖，最終產(chǎn)物為三糖和四糖。然而，現(xiàn)有的β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性并不滿足目前的工業(yè)應(yīng)用。在啤酒行業(yè)麥汁糖化過程中溫度是從48℃提高至78℃，而飼料行業(yè)中烘焙的溫度也在65℃以上。而目前篩選得到的大部分野生1,3-1,4-β-葡聚糖酶的最適溫度主要集中在45℃和55℃，而催化活性不高也是其不能推廣使用的重要原因。而目前市場上幾家酶制劑公司如諾維信、DMS研發(fā)生產(chǎn)的β-葡聚糖酶制劑價(jià)格昂貴，而目前國內(nèi)也有部分酶制劑公司生產(chǎn)β-葡聚糖酶制劑，但其水平遠(yuǎn)不及國外酶制劑公司，且β-葡聚糖酶制劑的生產(chǎn)菌種及工藝都是商業(yè)機(jī)密，國內(nèi)研發(fā)速率緩慢，因此國內(nèi)市場在很大程度上依然依賴進(jìn)口。因此，如果能夠提高野生型1,3-1,4-β-葡聚糖酶的催化活性及熱穩(wěn)定性，獲得高活性高熱穩(wěn)定的β-葡聚糖酶，那么就可以降低成本，推廣其在工業(yè)上的應(yīng)用。

為了提高1,3-1,4-β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性，國內(nèi)外已經(jīng)對其已經(jīng)進(jìn)行了一系列研究。對β-葡聚糖酶的雜交結(jié)果顯示，將浸麻芽孢桿菌(B.macerans)來源的前16個(gè)氨基酸替換為淀粉液化芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)來源的前16個(gè)氨基酸得到的雜交酶H(A16-M)和兩者之間前12個(gè)氨基酸進(jìn)行替換及刪除TYR13形成的雜交酶H(A12-M)-△13在高溫下有很好的穩(wěn)定性。GLN1、THR2、SER5和PHE7位點(diǎn)的突變大幅度的降低了β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性。這說明β-葡聚糖酶的N端對于該酶的熱穩(wěn)定性有重要的影響。而鈣離子對于在高溫下維持β-葡聚糖酶的穩(wěn)定性也有重要作用。針對β-葡聚糖酶中多個(gè)賴氨酸進(jìn)行定點(diǎn)突變研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)其中3個(gè)賴氨酸突變?yōu)榻z氨酸得到的三突變酶(BglTM)的熱穩(wěn)定性和催化活力都有了一定程度的提升。在β-葡聚糖酶三維結(jié)構(gòu)中添加N31C-T187C和P102C-N125C兩個(gè)二硫鍵也提高了β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性。但是目前得到的改造酶BglTM的熱穩(wěn)定性依舊不能適應(yīng)工業(yè)應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種1,3-1,4-β-葡聚糖酶突變體，尤其是一種具有更高熱穩(wěn)定性的1,3-1,4-β-葡聚糖酶突變體。