[發明專利]表達紅色熒光蛋白的重組沙門氏菌及其構建方法

有效

• 申請號: 201610139590.5
• 申請日: 2016-03-11
• 公開（公告）號: CN105695384B
• 公開（公告）日: 2019-04-23
• 發明（設計）人: 朱要宏;王九峰;胡雄;于嬌;張偉;彭玉璐
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12R1/42
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

本發明涉及表達紅色熒光蛋白的重組沙門氏菌及其構建方法，以臨床分離的沙門氏菌為轉化受體，將插入有紅色熒光蛋白基因片段的質粒pFPV?mCherry，電擊轉化進入菌體內，從而構建能夠表達紅色熒光的沙門氏菌。本發明構建的重組沙門氏菌，可以對該沙門氏菌的體外、體內試驗過程進行標記、示蹤，解決無法在沙門氏菌試驗中進行實時監測問題；重組菌可自身表達熒光蛋白，可以代替昂貴的沙門氏菌特異性抗體，不僅節約研究經費，還大大降低使用抗體所帶來的假陽性；結合相關蛋白的免疫熒光染色可進行共定位，為臨床分離的沙門氏菌的深入研究提供有效手段。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及一種表達紅色熒光蛋白的重組沙門氏菌及其構建方法。

背景技術

沙門氏菌屬(Salmonella)是沙門氏菌病的病原體。屬于腸桿菌科，革蘭氏陰性腸道桿菌。已發現的近千種沙門氏菌菌株，按其抗原成分，可分為甲、乙、丙、丁、戊等基本菌組。其中與人體疾病有關的主要有甲組的副傷寒甲桿菌，乙組的副傷寒乙桿菌和鼠傷寒桿菌，丙組的副傷寒丙桿菌和豬霍亂桿菌，丁組的傷寒桿菌和腸炎桿菌等。除傷寒桿菌、副傷寒甲桿菌和副傷寒乙桿菌引起人類的疾病外，大多數僅能目引起家畜、鼠類和禽類等動物的疾病，但有時也可污染人類的食物而引起食物中毒。

沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌。沙門氏菌最適繁殖溫度為37℃，在20℃以上即能大量繁殖，因此，低溫儲存食品是一項重要的預防措施。

構建能夠表達熒光蛋白的重組沙門氏菌，可為臨床分離的沙門氏菌的深入研究提供有效手段。國內已有表達綠色熒光蛋白的減毒鼠傷寒沙門氏菌的構建方法(王芳，江蘇農業研究,2001,22(3):55-58.)，該方法需將重組質粒轉化入沙門氏菌中間宿主后進行陽性克隆篩選，再從陽性菌體中提取出質粒，最終轉化入沙門氏菌終末宿主。該方法需要中間宿主的參與，過于繁瑣，且綠色熒光標記較為常見，如果試驗中需要與其他目的蛋白進行共定位，則二抗就不能再使用常見的FITC進行熒光標記。因此，有必要開發一種新型的能夠表達熒光蛋白的重組沙門氏菌。

發明內容

本發明的目的是提供一種表達紅色熒光蛋白的重組沙門氏菌及其構建方法。

為了實現本發明目的，本發明提供的表達紅色熒光蛋白的重組沙門氏菌，所述重組沙門氏菌是用質粒pFPV-mCherry轉化沙門氏菌獲得的陽性克隆。

本發明還提供所述重組沙門氏菌的構建方法，將質粒pFPV-mCherry通過電擊轉化的方式進入沙門氏菌體內，并篩選陽性克隆。

本發明所述的沙門氏菌包括但不限于德爾卑沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌。

前述的方法，優選用抗生素---氨芐青霉素篩選陽性克隆。

前述的方法具體包括以下步驟：

步驟1：質粒pFPV-mCherry的提取；

步驟2：沙門氏菌感受態細胞的制備；

步驟3：電擊轉化；

步驟4：陽性克隆的篩選；

步驟5：重組菌的形態學的鑒定、生長曲線測定、遺傳穩定性分析及毒力因子檢測。

步驟1具體為：用質粒提取試劑盒提取質粒pFPV-mCherry，提取后測定質粒濃度，使質粒濃度達到5pg-25ng/μL。例如，使用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit II試劑盒提取質粒，提取后使用ND-2000C測定濃度，調整合適濃度，使轉化時用量為1-2μL，質粒DNA含量為10pg-25ng。

步驟2具體為：