[發(fā)明專利]表達紅色熒光蛋白的重組沙門氏菌及其構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610139590.5
• 申請日: 2016-03-11
• 公開（公告）號: CN105695384B
• 公開（公告）日: 2019-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱要宏;王九峰;胡雄;于嬌;張偉;彭玉璐
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12R1/42
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.表達紅色熒光蛋白的重組沙門氏菌，其特征在于，所述重組沙門氏菌是用質(zhì)粒pFPV-mCherry轉(zhuǎn)化沙門氏菌獲得的陽性克隆；

其中，所述沙門氏菌為德爾卑沙門氏菌或嬰兒沙門氏菌。

2.權(quán)利要求1所述重組沙門氏菌的構(gòu)建方法，其特征在于，將質(zhì)粒pFPV-mCherry通過電擊轉(zhuǎn)化的方式進入沙門氏菌體內(nèi)，并篩選陽性克隆。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，用氨芐青霉素篩選陽性克隆。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：質(zhì)粒pFPV-mCherry的提??；

步驟2：沙門氏菌感受態(tài)細胞的制備；

步驟3：電擊轉(zhuǎn)化；

步驟4：陽性克隆的篩選；

步驟5：重組菌的形態(tài)學(xué)的鑒定、生長曲線測定、遺傳穩(wěn)定性分析及毒力因子檢測。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟1具體為：用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pFPV-mCherry，提取后測定質(zhì)粒濃度，使質(zhì)粒濃度達到5pg-25ng/μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2具體為：

(1)使用LB培養(yǎng)液于37℃200rpm的搖床振蕩培養(yǎng)沙門氏菌，測量培養(yǎng)液OD₆₀₀值，待OD₆₀₀值在0.35-0.45之間時，迅速將菌液冰浴15-30min，不時緩慢搖勻以保證菌液充分冷卻；

(2)4℃以4000g離心10min，回收細胞；然后用冰冷的純水重懸細胞后再次離心洗滌，將其中的電解質(zhì)雜質(zhì)洗掉，并逐步用10％甘油重懸、洗滌；最后以1ml冰冷的10％甘油重懸沉淀，得到懸液；

(3)稀釋上述步驟(2)得到的懸液后測量OD₆₀₀值，用冰冷的10％甘油將其稀釋至濃度為2×10¹⁰～3×10¹⁰個細胞/ml，準備電擊轉(zhuǎn)化。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟3具體為：

(1)用移液器吸取50μL新鮮制備或凍融的沙門氏菌感受態(tài)細胞于0.5ml冰冷的微量無菌離心管中，與電轉(zhuǎn)化儀樣品池一起放在冰上冷卻；

(2)以1-2μL的體積向每個離心管中加入10pg-25ng的待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA，置于冰上30-60s；

(3)調(diào)節(jié)電轉(zhuǎn)儀，使電脈沖為25μF，電壓2.5kV，電阻200Ω；將感受態(tài)細胞與質(zhì)粒DNA的混液加至冰冷的電擊杯內(nèi)，將電擊杯放進電轉(zhuǎn)儀中，按上述設(shè)定的參數(shù)，啟動對細胞的電脈沖；

(4)脈沖結(jié)束后，迅速取出樣品池，室溫下加入1ml LB肉湯培養(yǎng)基，37℃160rpm振蕩培養(yǎng)1h以復(fù)蘇細菌；

(5)取不同體積的電擊轉(zhuǎn)化后的細菌，鋪于含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基；室溫下待培養(yǎng)基中的液體被完全吸收，倒置瓊脂培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-16h。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟4具體為：

(1)配制LB肉湯培養(yǎng)基或LB瓊脂培養(yǎng)基，高壓滅菌后待其溫度降至50℃-55℃時，加入適量氨芐青霉素使其終濃度為100μg/mL；

(2)使用含有氨芐青霉素的LB液體或固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌，則為具有氨芐青霉素抗性的陽性克?。?/p>

(3)進一步使用選擇性培養(yǎng)基XLD/SS驗證篩選，在XLD/SS培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素培養(yǎng)的細菌為陽性克??；或者將培養(yǎng)后的菌涂于載玻片上，在熒光倒置顯微鏡下觀察，若能看到相應(yīng)的熒光，則為陽性克隆。