[發明專利]蛋白酶水解腸粘膜工藝在審

申請號：	201610138432.8	申請日：	2016-03-11
公開（公告）號：	CN107177014A	公開（公告）日：	2017-09-19
發明（設計）人：	陳文龍;張宏;宋磊	申請（專利權）人：	南通游龍腸衣食品有限公司
主分類號：	C08B37/10	分類號：	C08B37/10
代理公司：	暫無信息	代理人：	暫無信息
地址：	226500 江蘇省南通市***	國省代碼：	江蘇;32
權利要求書：	查看更多	說明書：	查看更多
摘要：
搜索關鍵詞：	蛋白酶水解粘膜工藝
鉆瓜網技術展會專利詞庫專利權人專利榜在售專利公布日期熱門專利

【說明書】：

技術領域

本發明涉及生物工程領域的一種蛋白酶水解腸粘膜工藝。

背景技術

肝素鈉是一種富含陰離子的粘多糖硫酸酯，由動物體內的肥大細胞和嗜堿性粒細胞產生，因最初從肝臟中提取，故名肝素。臨床使用的肝素是從動物腸、肺粘膜、血管壁等處提取獲得的鈉 ( 鋰 ) 鹽，肝素鈉 ( 鋰 ) 具有抗凝血、抗炎、抗癌等多種生物學功能，但長期使用會有諸如出血、骨折等負作用。20 世紀 80 年代初期發現低分子肝素鈉 (LMWH，(8000Da) 具有更強的活性和較小負作用，成為主要的臨床抗凝血藥。

目前國外已有10 多種LMWH 相繼問世，全球四大制藥企業均有該類產品的銷售，我國是主要的肝素原料國，產量約占全球的一半。應用于臨床的 LMWH 是由普通肝素為原料制備獲得，制備方法主要有生物酶法、化學裂解法兩種。它們各有優勢，肝素酶降解反應條件溫和、專一性高、副產物少而且引入一個紫外生色團，檢測方便，但酶的價格昂貴，難以跨越工業生產的界線。化學裂解法不可避免的會改變肝素鈉的結構、影響活性等。中國專利 ( 授權號 CNl096034) 公開了一種純化的肝素裂分其制備方法和含有它們的藥物組合物。純化的肝素裂分通過如下步驟制備：向肝素鈉中加入亞硝酸鹽，pHl— 5 處理 20— 50 分鐘，再在堿介質中以硼氫化鈉還原，用 HCL 破壞過量硼氫化鈉并用乙醇沉淀分級，將得到的溶液暴露在紫外照射系統下，溫度為 5℃一 50℃，pH 為 3— 8，色譜純化，最后用氯化鈉和乙醇沉淀分離得降解肝素鈉。美國專利 ( 公開號 3099600) 公開了一種色譜技術分離純化肝素鈉的方法：將肝素鈉粗品溶于緩沖溶液中，加入 5— 12 倍肝素鈉重量的離子交換樹脂 TEAM-c01lulose 或 DEAE-c01lulose，后用緩沖液洗滌，鹽洗脫，乙醇沉淀、干燥得產品。上述方法為工業上典型的制備及純化肝素鈉的過程，生產工藝復雜、成本高，而且沒有提及對肝素鈉的結構類似物多硫酸軟骨素這一主要雜質的去除方法。

發明內容

本發明的目的為了改進現有技術的不足而提供一種蛋白酶水解腸粘膜工藝；

該發明提供一種簡便的低分子肝素鈉制備、純化技術，制得的低分子肝素鈉平均分子質量在 4．5KDa 左右，效價不低于 180U ／ mg，高于中國藥典要求的 170U ／ mg，且依據中國藥典肝素鈉檢測標準檢測合格。

本發明的技術方案為：一種蛋白酶水解腸粘膜工藝，其具體步驟如下：

(1) 將粗品肝素鈉溶于 NaCl 溶液中，機械攪拌至肝素鈉全部溶解，向溶液中加入堿液直至產生沉淀，靜置，過濾除去不溶物，得濾液。

(2)將步驟 (1) 中濾液以堿液調 pH 至 9．5— 11，加入 H202 溶液，在 10— 30℃

下反應 2．5— 3．5 小時，得反應液。

(3)將步驟 (2) 得到的反應液升溫至 30— 50℃，此后每隔 2．5— 3．5 小時補加 H20 。

(4)向步驟 (3) 得到的反應液中加入吸附劑，磁力攪拌，過濾除不溶物，得濾液；

(5) 將步驟 (4) 中的濾液通過平衡好的凝膠色譜柱，收集低分子量的肝素鈉洗脫液。

(6) 將步驟 (5) 中的低分子量的肝素鈉洗脫液用弱堿性離子交換樹脂吸附，分別以三種濃度的 NaCl 溶液洗脫，收集第一種 ( 最低 )、第三種 ( 最高 ) 濃度的 NaCl 洗脫液并混合。

(7) 將步驟 (6) 中的混合洗脫液，在磁力攪拌下降溫至一 5— 8℃，再用乙醇沉淀、真空干燥得產品。