[發(fā)明專利]一種分離純化肝臟枯否細(xì)胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610137471.6
• 申請日: 2016-03-10
• 公開（公告）號: CN105586306A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂凌;陸云杰;古鑒
• 申請（專利權(quán)）人: 南京愛瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責(zé)任公司 32102
• 代理人: 何朝旭;朱磊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種分離純化細(xì)胞的方法，尤其涉及一種分離純化 肝臟枯否細(xì)胞的方法，屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

肝臟的免疫應(yīng)答反應(yīng)與肝癌、肝炎病毒感染和慢性肝病肝損傷等 多種肝臟疾病相關(guān)，已經(jīng)得到越來越多的關(guān)注和研究。巨噬細(xì)胞是人 體重要的免疫細(xì)胞，且肝內(nèi)的枯否細(xì)胞對于肝臟本身和全身的免疫應(yīng) 答都極為重要。肝臟枯否細(xì)胞約占肝臟總細(xì)胞的15％，全身巨噬細(xì)胞 的50％，主要位于肝竇壁，是腸源性病原體在肝內(nèi)首先接觸的細(xì)胞， 是肝內(nèi)重要的固有免疫細(xì)胞之一，參與固有免疫反應(yīng)，還能通過分泌 促炎因子和趨化因子，影響其他免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等 的活化和肝內(nèi)的聚集，參與影響固有免疫和先天免疫的交互影響，產(chǎn) 生進(jìn)一步的免疫應(yīng)答。對枯否細(xì)胞的進(jìn)一步深入的研究，首先必須建 立一種高效的細(xì)胞分離純化方法。1977年首次通過實(shí)驗(yàn)分離出鼠類 肝臟枯否細(xì)胞，上世紀(jì)90年代通過密度梯度離心獲得了較高純度和 活性的鼠肝臟枯否細(xì)胞，本世紀(jì)初Valatas等人又根據(jù)枯否細(xì)胞貼壁 的特性，對分離純化方法作了進(jìn)一步改進(jìn)，通過肝臟組織消化處理、 密度梯度離心、密度梯度離心和貼壁選擇四步法，使枯否細(xì)胞純度達(dá) 95％左右，細(xì)胞得率達(dá)80-100×10⁶個(gè)/肝。但是，密度梯度法設(shè)備昂 貴復(fù)雜，在未具備條件的實(shí)驗(yàn)室難以開展，耗時(shí)長，且無法得到所需 特定表型的枯否細(xì)胞。綜上所述，機(jī)械灌注和密度梯度離心法，雖然 可以獲得較高純度和活性的枯否細(xì)胞，但存在以下缺點(diǎn)：一，密度梯 度離心法設(shè)備較為昂貴，一些實(shí)驗(yàn)室不能夠滿足實(shí)驗(yàn)條件；二，分選 時(shí)間較長，對細(xì)胞活性及后續(xù)實(shí)驗(yàn)可能存在影響；三，操作較為復(fù)雜， 技術(shù)掌握較為困難。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提出一種分離純化 肝臟枯否細(xì)胞的方法，滿足實(shí)驗(yàn)條件，操作簡單，耗時(shí)短的同時(shí)獲 得高純度的肝臟枯否細(xì)胞。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案解決技術(shù)問題：一種分離純化肝臟枯 否細(xì)胞的方法，包括在無菌條件下進(jìn)行以下步驟：

第一步、建立肝臟機(jī)械灌注系統(tǒng)，在離體的肝臟、門靜脈、肝 下下腔靜脈及行門靜脈置管并固定，管中注入0.1ml肝素，在右心 房行上腔靜脈置管并固定，結(jié)扎肝下下腔靜脈后，分別將門靜脈置 管和上腔靜脈置管連接至機(jī)械灌注蠕動(dòng)泵形成閉合環(huán)路；

第二步、獲得細(xì)胞，利用肝臟機(jī)械循環(huán)灌注系統(tǒng)，依次行肝臟 灌注消化，切取肝臟置于培養(yǎng)皿內(nèi)，分離去除肝臟包膜，將細(xì)胞懸 液經(jīng)200目濾網(wǎng)濾過，轉(zhuǎn)至離心管后置于旋轉(zhuǎn)搖蕩器，37℃、140rpm 震蕩10分鐘，50G離心1分鐘后取上清，再150G離心8分鐘棄上清， 即得富含肝非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞懸液；

第三步、免疫磁珠三標(biāo)兩步法分離F4/80⁺CD11b^-CD11c^-枯否細(xì) 胞，先進(jìn)行陰選，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，加入相應(yīng)劑量CD11bFITC， CD11cPE抗體，4℃15分鐘，PBS洗滌一次，同時(shí)加入Anti-PE Microbeads和Anti-FITCMicrobeads，4℃15分鐘，LS分選柱行 陰選，收集過磁柱后的細(xì)胞懸液；再進(jìn)行陽選，根據(jù)陰選后細(xì)胞懸 液細(xì)胞數(shù)量，加入相應(yīng)劑量的F4/80APC抗體，4℃15分鐘，PBS 洗滌一次，加入Anti-APCMicrobeads，4℃15分鐘，MS分選柱行 陽選，收集磁柱中的細(xì)胞，即為F4/80⁺CD11b^-CD11c^-枯否細(xì)胞；

第四步、純度檢測，取肝臟機(jī)械循環(huán)灌注后10⁵級細(xì)胞重懸于 100微升PBS中，加入CD11bFITC、CD11cPE、F4/80APC流式抗體， 4℃避光孵育30-45分鐘，PBS洗滌兩次，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型 和純度。

上述方法的所述第二步中，消化的條件為EMEM4ml/min*10min， 0.45％Pronase4ml/min*15min，0.02％Collagenase4ml/min*8min。 離心管內(nèi)含有10μg/ml、40ml的DNase。