[發明專利]一種分離純化肝臟枯否細胞的方法

在審

• 申請號: 201610137471.6
• 申請日: 2016-03-10
• 公開（公告）號: CN105586306A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發明（設計）人: 呂凌;陸云杰;古鑒
• 申請（專利權）人: 南京愛瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 何朝旭;朱磊

1.一種分離純化肝臟枯否細胞的方法，包括在無菌條件下，進行以 下步驟：

第一步、建立肝臟機械灌注系統，在離體的肝臟、門靜脈、 肝下下腔靜脈及行門靜脈置管并固定，管中注入0.1ml肝素，在 右心房行上腔靜脈置管并固定，結扎肝下下腔靜脈后，分別將門 靜脈置管和上腔靜脈置管連接至機械灌注蠕動泵形成閉合環路；

第二步、獲得細胞，利用肝臟機械循環灌注系統，依次行肝 臟灌注消化，切取肝臟置于培養皿內，分離去除肝臟包膜，將細 胞懸液經200目濾網濾過，轉至離心管后置于旋轉搖蕩器，將實 驗室水浴震蕩器設定至37℃、140rpm，震蕩10分鐘，而后轉入 離心機中50G離心1分鐘后取上清，再將上清以150G離心8分鐘 棄上清，即得富含肝非實質性細胞懸液；

第三步、免疫磁珠分離F4/80⁺CD11b^-CD11c^-枯否細胞，先進 行陰選，根據細胞計數結果，加入5ul/10⁷的CD11bFITC，CD11cPE 抗體，4℃孵育15分鐘，PBS洗滌一次，同時加入Anti-PE Microbeads和Anti-FITCMicrobeads，4℃孵育15分鐘，LS分 選柱行陰選，收集過磁柱后的細胞懸液；

再進行陽選，根據陰選后細胞懸液細胞數量，加入5ul/10⁷的 F4/80APC抗體，4℃孵育15分鐘，PBS洗滌一次，加入Anti-APC Microbeads，4℃孵育15分鐘，MS分選柱行陽選，收集磁柱中的 細胞，即為F4/80⁺CD11b^-CD11c^-枯否細胞。

第四步、純度檢測，取肝臟機械循環灌注后10^5級細胞重懸 于100微升PBS中，加入CD11bFITC、CD11cPE、F4/80APC流 式抗體，4℃避光孵育30-45分鐘，PBS洗滌兩次，流式細胞儀檢 測細胞表型和純度。

2.根據權利要求1所述分離純化肝臟枯否細胞的方法，其特征是： 所述第二步中，消化的條件為EMEM4ml/min*10min，0.45％ Pronase4ml/min*15min，0.02％Collagenase4ml/min*8min。

3.根據權利要求1所述分離純化肝臟枯否細胞的方法，其特征是： 所述第二步中，離心管內含有10μg/ml、40ml的DNase。