[發(fā)明專利]一種漢遜酵母表達(dá)的重組乙肝表面抗原的分離純化方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610137254.7
• 申請(qǐng)日: 2016-03-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105693826A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃恩啟;吳常偉;李超;王力衛(wèi);劉術(shù)敏;程英杰;陶立峰;楊世龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/02
• 分類號(hào): C07K14/02;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;C07K1/16;A61K39/29;A61P31/20
• 代理公司: 合肥天明專利事務(wù)所 34115
• 代理人: 孫永剛

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種漢遜酵母表達(dá)的重組乙肝表面抗原的分離純化方法及其應(yīng)用，屬 于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

乙型肝炎(簡(jiǎn)稱乙肝)疫苗已大規(guī)模使用愈20年，但乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus，HBV)感染仍是最為嚴(yán)重的全球性健康問(wèn)題之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全世界約20 億人有現(xiàn)狀或既往乙肝病毒感染標(biāo)志，每年約有60萬(wàn)人死于HBV感染引起的肝衰竭、肝硬化 和肝細(xì)胞癌。我國(guó)乙肝病毒攜帶者超過(guò)1億，現(xiàn)有患者超過(guò)2000萬(wàn)，南方流行重于北方，農(nóng)村 重于城市。目前并無(wú)特異性治療乙肝的藥物，最有效的手段就是接種乙肝疫苗。

第一代乙肝疫苗為血源疫苗，采用無(wú)癥狀帶毒者(HBsAg陽(yáng)性)血漿為原料制備。由 于提取方法不同，所得成分也有差別，但均含提純的22nm小顆粒乙型肝炎表面抗原。80年代 以來(lái)開(kāi)始研制第二代乙肝疫苗，系將S基因編碼的226個(gè)氨基酸產(chǎn)物裝配而成的抗原顆粒， 采用基因工程方法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和重組酵母中均能表達(dá)。重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母) 乙肝疫苗是最新一代基因工程乙肝疫苗，是繼血源疫苗、釀酒酵母疫苗之后的第三代疫苗， 系國(guó)家863重大科技攻關(guān)成果，已有2000萬(wàn)名受種者驗(yàn)證了其安全性。對(duì)HBsAg陽(yáng)性母親所 生新生兒，本市已將母嬰阻斷率較高的重組(漢遜酵母)乙肝疫苗納入免疫規(guī)劃，在出生12 小時(shí)內(nèi)給予免費(fèi)接種；在本地的臨床觀察中，健康成人全程接種后1個(gè)月，97.46％的受種者 抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)；全程接種后半年，59.8％的受種者抗體水平在1000mIU/mL以上，因而保護(hù)期更 長(zhǎng)。按照世界衛(wèi)生組織資料，不同乙肝疫苗的相對(duì)效力不以HBsAg含量來(lái)判斷，10ug重組(漢 遜酵母)疫苗適用于任意年齡的易感人群，能提供全面高效持久的免疫保護(hù)屏障。免疫預(yù)防 為主，有效遏制乙肝的高流行狀態(tài)，基因重組(漢遜酵母)技術(shù)為乙型肝炎的免疫預(yù)防提供 了一種全新的選擇。

多形漢遜酵母(HansenulaPolymorpha)，又稱作Pichiaaugusta，是當(dāng)前公認(rèn)的 最為理想的外源基因表達(dá)系統(tǒng)之一。漢遜酵母也是一種甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母，與畢赤酵母類似。 漢遜酵母中甲醇代謝的主要途徑有兩種(LodeboerA.M.，etal.，1985)：一種是在過(guò)氧化物 酶體中進(jìn)行，甲醇在甲醇氧化酶(methanoloxidase，MOX)作用下生成甲醛和H₂O₂，甲醛再經(jīng) 甲醛脫氫酶(formaldehydedehydrogenase)和甲酸脫氫酶(formatedehydrogenase，F(xiàn)MD) 作用下生成CO₂，H₂O₂在過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)的作用下生成H₂O和O₂；甲醇的另一個(gè)代 謝途徑發(fā)生在過(guò)氧化物酶體外，甲醇在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)過(guò)一系列酶的催化作用最后轉(zhuǎn)變?yōu)樘? 類，其中二羥丙酮合成酶(dihydroxyacetonesynthase，DHAS)是這一過(guò)程的關(guān)鍵酶。甲醇 代謝過(guò)程中的各種關(guān)鍵酶，包括MOX、DHAS和CAT等的表達(dá)都是在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)解的，它們 受甲醇、甘油和山梨醇的誘導(dǎo)，受葡萄糖和乙醇的阻遏，但當(dāng)葡萄糖濃度低于0.1％時(shí)，阻遏 作用即被解除。在甲醇完全誘導(dǎo)條件下，過(guò)氧化物酶體可占細(xì)胞總體積的80％，MOX和DHAS 可占細(xì)胞總蛋白的15％，它們的啟動(dòng)子具有極強(qiáng)的啟動(dòng)下游基因表達(dá)的功能，目前已被用 作外源基因在酵母中表達(dá)的常用啟動(dòng)子。漢遜酵母作為單細(xì)胞真核微生物，既具備原核生 物生長(zhǎng)快速、易于遺傳操作等特點(diǎn)，又有真核細(xì)胞翻譯后加工和修飾等功能。此外，漢遜酵 母還具備安全性好、易于培養(yǎng)、成本低廉、表達(dá)量高及遺傳穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，并且能夠克服諸如 釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株不穩(wěn)定、產(chǎn)量低及糖基化側(cè)鏈過(guò)長(zhǎng)以及畢赤酵 母(PichiaPastoris)外源基因整合拷貝數(shù)較低的問(wèn)題。目前，應(yīng)用漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn) 的藥物(如胰島素，商品名Wosulin)及HBV疫苗(商品名Hepavax-Gene)均已上市銷售。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種漢遜酵母表達(dá)的重組乙肝表面抗 原的分離純化方法及其應(yīng)用，適用于規(guī)模化生產(chǎn)HBsAg重組蛋白。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的一種分離純化漢遜酵母表達(dá)的重組乙肝表面抗 原的方法，包括以下步驟：