[發明專利]一種非抗生素篩選標記的轉化紫花苜蓿葉綠體基因組的表達載體的構建方法

在審

• 申請號: 201610136848.6
• 申請日: 2016-03-10
• 公開（公告）號: CN105586357A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發明（設計）人: 楊國鋒;趙怡然;蘇昆龍;宋智斌;苗福泓;孫娟;劉洪慶;李海梅
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙) 11130
• 代理人: 王為;孟旭

技術領域

本發明涉及一種基因工程技術領域中的重組載體構建，特別涉及一種重組的 使用非抗生素進行篩選標記的用于轉化紫花苜蓿葉綠體基因組的高效表達載體 的構建。

背景技術

1996年首例轉基因作物被批準投入市場進行種植，隨著20多年的發展，全 世界目前已有25種轉基因作物批準投入市場進行商業化生產，涉及的作物主要 有大豆、玉米、棉花、油菜等，主要是在抗蟲及抗除草劑方面。截止到2014年 已有28個國家超過1.7億公頃的轉基因作物種植^[83]。雖然轉基因作物產業飛速 發展，但是公眾對轉基因存在的安全問題仍存在很大的擔憂，反對轉基因呼聲從 未停止過。

從原理上來看，轉基因作物存在的風險主要是對環境安全和食品安全方面。 環境安全方面，考慮到花粉漂移可能會造成超級雜草使得常規的除草劑不再起作 用，同時對生物多樣性以及環境承受壓力等方面也會產生影響。食品安全性方面， 轉入基因所表達的蛋白是否會對人體或動物產生影響，轉基因過程中使用的抗生 素標記基因對人或動物腸道微生物帶來的影響等。如今如何建立安全的轉基因技 術體系成為了目前轉基因技術研究的熱點方向。

本發明經過研究，提供一種重組的使用非抗生素進行篩選標記的用于轉化紫 花苜蓿葉綠體基因組的高效表達載體，該載體將用于以下方面：

外源基因轉化紫花苜蓿葉綠體基因組研究并用以改良紫花苜蓿品質；

作為安全的轉基因技術載體，進行安全的轉基因技術研究。

發明內容

本發明提供一種非抗生素篩選標記的轉化紫花苜蓿葉綠體基因組的植物表 達載體，所述載體包括紫花苜蓿葉綠體基因組中的TrnA-TrnI基因片段，非抗 生素篩選標記基因BADH基因，用于高效表達的調控序列煙草葉綠體基因組啟動 子Prrn和終止子Tpsba連接的重組質粒，其基因序列為序列表1的序列。

本發明所述的植物表達載體，其中的TrnA-TrnI基因片段為序列表2的序 列。

本發明所述的植物表達載體，其中的BADH基因序列為序列表3的序列。

本發明所述的植物表達載體，其中的啟動子Prrn序列為序列表4的序列。

本發明所述的植物表達載體，其中的終止子Tpsba序列為列表5的序列

本發明所述的植物表達載體，通過對pUCM-T克隆載體的多克隆位點處插入 TrnA-TrnI基因片段后進行改造得到的。

本發明所述的植物表達載體，其中，添加相關基因及序列后共改造1條載體， 其添加的基因和調控序列依次排列順序為：

TrnA-Prrn-BADH-Tpsba-Prrn-Afe1-Tpsba。

本發明進一步提供所述的植物表達載體的制備方法，所述方法，步驟如下：

步驟1，使用PCR擴增紫花苜蓿TrnA-TrnI片段，并使用T/A克隆方法連接 到pUCM-T載體上，

步驟2，使用三引物PCR克隆方法將啟動子序列與終止子序列連接到篩選標 記基因BADH兩端，并使用T/A克隆方法連接到pUCM-T載體上，

步驟3，使用三引物PCR克隆方法將啟動子序列與終止子序列中間插入平末 端酶切位點Afe1。并使用T/A克隆方法連接到pUCM-T載體上，

步驟4，葉綠體轉化載體的構建

優選的，本發明所述的植物表達載體的制備方法，步驟如下：

步驟1、基因擴增，

TrnA-TrnI序列：以紫花苜蓿葉綠體基因組為模板，使用引物TrnA-F、TrnI-R 進行克隆，連接到T載體上命名為pTrnA-TrnI；

步驟2，三引物PCR克隆方法將啟動子序列與終止子序列連接到篩選標記基 因BADH兩端，連接到T載體上命名為pPaT，

步驟3，三引物PCR克隆方法將啟動子序列與終止子序列之間插入Afe1酶 切位點，連接到T載體上命名為pPAfe1T，

步驟4，構建紫花苜蓿葉綠體表達載體pAfe1A。

更優選的，本發明所述的植物表達載體的制備方法，步驟如下：

步驟1，TrnA-TrnI片段的克隆：