[發明專利]一種非抗生素篩選標記的轉化紫花苜蓿葉綠體基因組的表達載體的構建方法

在審

• 申請號: 201610136848.6
• 申請日: 2016-03-10
• 公開（公告）號: CN105586357A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發明（設計）人: 楊國鋒;趙怡然;蘇昆龍;宋智斌;苗福泓;孫娟;劉洪慶;李海梅
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙) 11130
• 代理人: 王為;孟旭

1.一種非抗生素篩選標記的轉化紫花苜蓿葉綠體基因組的植物表達載體， 其特征在于，包括紫花苜蓿葉綠體基因組中的TrnA-TrnI基因片段，非抗生素篩 選標記基因BADH基因，用于高效表達的調控序列煙草葉綠體基因組啟動子Prrn 和終止子Tpsba連接的重組質粒，其基因序列為序列表1的序列。

2.根據權利要求1所述的植物表達載體，其中的TrnA-TrnI基因片段為序 列表2的序列。

3.根據權利要求1所述的植物表達載體，其中的BADH基因序列為序列表 3的序列。

4.根據權利要求1所述的植物表達載體，其中的啟動子Prrn序列為序列表 4的序列。

5.根據權利要求1所述的植物表達載體，其中的終止子Tpsba序列為列表 5的序列。

6.根據權利要求1所述的植物表達載體，通過對pUCM-T克隆載體的多克 隆位點處插入TrnA-TrnI基因片段后進行改造得到的。

7.根據權利要求6所述的植物表達載體，其中，添加相關基因及序列后共 改造1條載體，其添加的基因和調控序列依次排列順序為：

TrnA-Prrn-BADH-Tpsba-Prrn-Afe1-Tpsba。

8.權利要求1所述的植物表達載體的制備方法，所述方法，步驟如下：

步驟1，使用PCR擴增紫花苜蓿TrnA-TrnI片段，并使用T/A克隆方法連接 到pUCM-T載體上，

步驟2，使用三引物PCR克隆方法將啟動子序列與終止子序列連接到篩選 標記基因BADH兩端，并使用T/A克隆方法連接到pUCM-T載體上，

步驟3，使用三引物PCR克隆方法將啟動子序列與終止子序列中間插入平 末端酶切位點Afe1，并使用T/A克隆方法連接到pUCM-T載體上，

步驟4，葉綠體轉化載體的構建。

9.權利要求8所述的植物表達載體的制備方法，所述方法，步驟如下：

步驟1、基因擴增，

TrnA-TrnI序列：以紫花苜蓿葉綠體基因組為模板，使用引物TrnA-F、TrnI-R 進行克隆，連接到T載體上命名為pTrnA-TrnI；

步驟2，三引物PCR克隆方法將啟動子序列與終止子序列連接到篩選標記 基因BADH兩端，連接到T載體上命名為pPaT，

步驟3，三引物PCR克隆方法將啟動子序列與終止子序列之間插入Afe1酶 切位點，連接到T載體上命名為pPAfe1T，

步驟4，構建紫花苜蓿葉綠體表達載體pAfe1A。

10.權利要求8所述的植物表達載體的制備方法，所述方法，步驟如下：

步驟1，TrnA-TrnI片段的克?。?

以苜蓿葉綠體基因組為模板，使用引物TrnA-F、TrnI-R進行克??；PCR擴 增條件：94℃預變性5min，94℃變性60s，62℃退火30s，72℃延伸min，35個 循環后，72℃延伸5min，反應產物4℃保存，

使用1％瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物，連接到T載體上命名為pTrnA-TrnI，

步驟2，使用三引物PCR克隆方法將啟動子序列與終止子序列連接到篩選標 記基因BADH兩端，

第一步，PCR擴增基因融合片段：

以煙草葉綠體基因組為模板使用引物Prrn-F-KpnⅠ、Prrn-BADH-R擴增啟動 子Prrn，擴增程序：94℃，5min；94℃，1.5min；65℃，45s；72℃，30s；35 個循環；72℃，10min；4℃保存，回收產物分別記作：Prrn-BADH，

以人工合成的BADH為模板擴增含有終止子Tpsba的小片段序列，使用引物 BADH-F-Rong、BADH-Tpsba-R，擴增程序：94℃，5min；94℃，1.5min； 58℃，30s；72℃，1.5min；35個循環；72℃，10min；4℃保存，回收產物記 作：BADH，

以煙草葉綠體基因組為模板使用引物Tpsba-F-RONG、Tpsba-R-BgIⅡ擴增 終止子Tpsba，擴增程序：94℃，5min；94℃，1.5min；57℃，30s；72℃， 30s；35個循環；72℃，10min；4℃保存，回收產物分別記作：Tpsba-BgIⅡ，

上述PCR反應體系及PCR擴增進行凝膠電泳回收均按照本文第三部分中所 描述的進行，

第二步：使用PCR對基因進行融合：

啟動子Prrn、BADH基因、終止子Tpsba的融合：

取第一步中的回收產物Prrn-BADH和BADH，PCR反應體系(總25μL)： 10×ExBuffer2.5μl，dNTP(2.5mM)2μl，Prrn-BADH2μL，BADH2μL，ExTaq酶 (5U/μl)0.3μl，ddH2O16.2μL，反應條件：94℃，5min；94℃，45s；64℃， 45s；72℃，1.5min；10個循環；72℃，10min；4℃保存，反應結束后向反應體 系中加入引物Prrn-F-KpnⅠ和BADH-Tpsba-R各0.5μL，以反應條件：94℃， 5min；94℃，1min；60℃，45s；72℃，1.5min；35個循環；72℃，10min；4℃ 保存，反應結束后使用0.1％瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物，記作BADH-T，取 回收產物BADH-T和Tpsba-BgIⅡ，PCR反應體系(總25μL)：10×ExBuffer 2.5μl，dNTP(2.5mM)2μl，BADH-T2μL，Tpsba-BgIⅡ2μL，ExTaq酶(5U/μl) 0.3μl，ddH2O16.2μL，反應條件：94℃，5min；94℃，45s；60℃，40s； 72℃，1.5min；10個循環；72℃，10min；4℃保存，反應結束后向反應體系中 加入引物Prrn-F-KpnⅠ和Tpsba-R-BgIⅡ各0.5μL，以反應條件：94℃，5min； 94℃，1min；58℃，45s；72℃，2min；35個循環；72℃，10min；4℃保存， 使用0.1％瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物，通過T/A克隆連接到pUCM-T載體 上，命名為pPaT，

步驟3，三引物PCR克隆方法將啟動子序列與終止子序列之間插入Afe1酶 切位點，

以煙草葉綠體基因組為模板分別擴增含有Afe1酶切位點和Tpsba終止子 5’部分基因的啟動子Prrn(引物：Prrn-F-BgIⅡ和Prrn-R-Afe1)，擴增程序： 94℃，5min；94℃，1.5min；65℃，45s；72℃，30s；35個循環；72℃，10min； 4℃保存，回收產物記作：Prrn-Afe1，以pTpsba為模板擴增在終止子3’含有Sal Ⅰ(引物：Tpsba-F-RONG/Tpsba-R-SalⅠ),擴增程序：94℃，5min；94℃，1.5min； 57℃，30s；72℃，30s；35個循環；72℃，10min；4℃保存，回收產物分別記 作：Tpsba-SalⅠ，上述PCR反應體系及PCR擴增進行凝膠電泳回收均按照本 文第三部分中所描述的進行，第二步：使用PCR對基因進行融合：啟動子 Prrn-Afe1與終止子Tpsba的融合：取第一步中的回收產物Prrn-Afe1和 Tpsba-SalⅠ，PCR反應體系(總25μL)：10×ExBuffer2.5μl，dNTP(2.5mM) 2μl，Prrn-Afe12μL，Tpsba-SalⅠ2μL，ExTaq酶(5U/μl)0.3μl，ddH2O16.2 μL，反應條件：95℃，5min；95℃，45s；64℃，45s；72℃，1min；10個循環； 72℃，10min；4℃保存，反應結束后向反應體系中加入引物Prrn-F-BgIⅡ和 Tpsba-R-SalⅠ各0.5μL，以反應條件：94℃，5min；94℃，1min；61℃，45s； 72℃，1.5min；35個循環；72℃，10min；4℃保存，反應結束后使用0.1％瓊 脂糖凝膠電泳回收PCR產物，通過T/A克隆連接到pUCM-T載體上，命名為 pPAfe1T，

步驟4，構建紫花苜蓿葉綠體表達載體pAfe1A，

對載體pPaT、pPAfe1T使用BgIⅡ和KpnⅠ雙酶切，酶切后使用0.1％瓊 脂糖凝膠電泳，pPaT和pPBT雙酶切后回收較小的片段分別與pPFT雙酶切后 回收的大片段連接，構建成新的載體，分別命名為pAfe1A。