[發明專利]一種篩選對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的MDBK細胞系的方法

有效

• 申請號: 201610136832.5
• 申請日: 2016-03-10
• 公開（公告）號: CN105734007B
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發明（設計）人: 商曉桂;孔彩萍;韓志玲;郝鵬;羨東堡;田志輝;王云凌;范秀麗;劉國英;魏學峰
• 申請（專利權）人: 金宇保靈生物藥品有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;G01N33/569
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

本發明公開了一種篩選對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的MDBK細胞系的方法。先對MDBK細胞進行單克隆，然后接種兩種生物型(致細胞病變型和非致細胞病變型)的牛病毒性腹瀉/黏膜病毒，最后用間接免疫熒光技術測定病毒滴度，確定病毒滴度高于10⁶TCID₅₀/mL的為對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的MDBK細胞系。本發明篩選的MDBK細胞系對兩種生物型的牛病毒性腹瀉/黏膜病毒均敏感，可直接應用于牛病毒性腹瀉/黏膜病疫苗的研究和生產。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，特別是涉及一種篩選對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的MDBK細胞系的方法。

背景技術

牛病毒性腹瀉/黏膜病(bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹瀉/黏膜病毒(bovine viraldiarrhea virus，BVDV)引起牛發生的一種傳染病。其病原牛病毒性腹瀉/黏膜病毒是黃病毒科瘟病毒屬的成員，是一種單股RNA、有囊膜的病毒。根據是否可使培養細胞產生細胞病變，可將牛病毒性腹瀉/黏膜病毒分為兩種生物型：一種為病毒在細胞中復制不引起細胞病變，稱為非致細胞病變型；另一種為病毒在細胞中復制引起細胞形成空泡、發生核固縮、溶解和死亡等病變，稱為致細胞病變型。

牛病毒性腹瀉/黏膜病毒感染奶牛后的臨床表現主要為發熱﹑腹瀉、產奶量下降、胃腸炎、不同程度的牛病毒性腹瀉/黏膜病，出現免疫抑制從而繼發其它感染。母畜感染后可造成流產，產出死胎、畸形胎，在特定的妊娠階段感染牛病毒性腹瀉/黏膜病毒后可分娩出持續性感染牛。牛病毒性腹瀉/黏膜病在全球范圍內分布流行，是世界范圍內流行的嚴重威脅養牛業的兩種重大疾病，為世界動物衛生組織(Office International DesEpizooties，OIE)法定報告的動物疫病，我國進出口檢疫中把其定為B類傳染病。除給養牛業造成巨大經濟損失外，因牛病毒性腹瀉/黏膜病毒感染牛后可產生持續性感染，導致病牛機體免疫機能損害，甚至終身帶毒、散毒，成為養牛業的“隱型炸彈”，嚴重威脅養牛業的安全。

國外針對牛病毒性腹瀉/黏膜病病主要采取疫苗接種和淘汰持續感染病畜的綜合防治措施。而國內由于起步較晚，對牛病毒性腹瀉/黏膜病未引起足夠重視，尚未有商品化的疫苗，導致目前該疾病全國范圍內嚴重流行，急需開展相關疫苗研究，為我國防控并最終根除這種疾病提供安全有效的疫苗保障。目前，國內的牛病毒性腹瀉病疫苗研究主要是利用MDBK(牛腎細胞)接種牛病毒性腹瀉/黏膜病毒流行毒株的細胞培養物而產生的弱毒疫苗或者滅活疫苗。疫苗中病毒滴度的高低是疫苗免疫效果的決定性因素，因此，選育一株對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的細胞系，提高病毒滴度對牛病毒性腹瀉/黏膜病疫苗的生產具有現實意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種篩選對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的MDBK細胞系的方法。

為解決以上技術問題，本發明采取以下技術方案：一種篩選對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的MDBK細胞系的方法，先對MDBK細胞進行單克隆，然后接種兩種生物型(致細胞病變型和非致細胞病變型)的牛病毒性腹瀉/黏膜病毒，最后用間接免疫熒光技術測定病毒滴度，病毒滴度高于10⁶TCID₅₀/mL的為對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的MDBK細胞系。其中：

對MDBK細胞進行單克隆包括以下步驟：用含10％(體積/體積，V/V，單位mL/100mL)胎牛血清的MEM培養基將無外源病毒污染的MDBK細胞培養至鋪滿細胞培養瓶瓶底，用0.25％(質量/體積，W/V，單位g/100mL)的胰蛋白酶液消化成單個散在細胞，用含10％(體積/體積，V/V，單位mL/100mL)胎牛血清的MEM培養基在96孔板培養單個散在細胞，標記只含有一個細胞的孔，待細胞數量增加后，再擴大培養，得到MDBK單克隆細胞。