[發明專利]一種篩選對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的MDBK細胞系的方法

有效

• 申請號: 201610136832.5
• 申請日: 2016-03-10
• 公開（公告）號: CN105734007B
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發明（設計）人: 商曉桂;孔彩萍;韓志玲;郝鵬;羨東堡;田志輝;王云凌;范秀麗;劉國英;魏學峰
• 申請（專利權）人: 金宇保靈生物藥品有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;G01N33/569
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

1.一種篩選對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的MDBK細胞系的方法，先對MDBK細胞進行單克隆，然后接種致細胞病變型和非致細胞病變型兩種生物型的牛病毒性腹瀉/黏膜病毒，最后用間接免疫熒光技術測定病毒滴度，確定病毒滴度高于10⁶TCID₅₀/mL的為對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的MDBK細胞系；

對MDBK細胞進行單克隆包括以下步驟：用含體積濃度10％胎牛血清的MEM培養基將無外源病毒污染的MDBK細胞培養至鋪滿細胞培養瓶瓶底，用質量體積濃度0.25％的胰蛋白酶液消化成單個散在細胞，用含體積濃度10％胎牛血清的MEM培養基在96孔板培養單個散在細胞，標記只含有一個細胞的孔，待細胞數量增加后，再擴大培養，得到MDBK單克隆細胞。

2.根據權利要求1所述的篩選對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的MDBK細胞系的方法，其特征在于，所述接種的兩種生物型的牛病毒性腹瀉/黏膜病毒為致細胞病變型BVDV1株和非致細胞病變型BVDV2株的混合毒液。

3.根據權利要求2所述的篩選對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的MDBK細胞系的方法，其特征在于，BVDV1株和BVDV2株各0.5mL，BVDV1株病毒毒價為10^5.0TCID₅₀/mL，BVDV2株病毒毒價為10^4.5TCID₅₀/mL，加入1.5mL EP管中混勻形成混合毒液。

4.根據權利要求3所述的篩選對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的MDBK細胞系的方法，其特征在于，MDBK單克隆細胞繼續在培養箱培養至MDBK細胞生長覆蓋率為85％-95％的單層后，接種BVDV1株和BVDV2株混合毒液。

5.根據權利要求4所述的篩選對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的MDBK細胞系的方法，其特征在于，所述混合毒液按10倍梯度稀釋，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-75個稀釋度，每個稀釋度平行接種8孔，然后加入細胞培養板中，每孔50μL，吸附1h，然后補加含體積濃度2％胎牛血清的MEM培養基至200μL培養。

6.根據權利要求1至5任一項所述的篩選對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的MDBK細胞系的方法，其特征在于，細胞培養環境為37℃、5％CO₂。

7.根據權利要求1至5任一項所述的篩選對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的MDBK細胞系的方法，其特征在于，間接免疫熒光技術測定病毒滴度的方法為：

固定：培養板上MDBK細胞接種兩種生物型的牛病毒性腹瀉/黏膜病毒后在37℃、5％CO₂培養箱中培養8-10h后，棄去培養基，用PBST液洗板，每孔加入150μL預冷丙酮，置于4℃冰箱固定15-20min；

抗體孵育：取出細胞培養板，棄去固定液，用PBST洗板，將BVDV單克隆抗體為一抗按照1:1000稀釋后加入細胞培養板，每孔50μL，將細胞培養板置于濕盒中，37℃孵育1h，棄去一抗，用PBST洗板，將FITC標記的羊抗鼠IgG為二抗按照1:2000稀釋后，將培養板置于濕盒中，37℃孵育1h；

熒光觀察：棄去標記抗體，用PBST洗板，置于熒光顯微鏡下觀察熒光，細胞胞漿中顯示特異性黃綠色熒光判定為陽性；

MDBK細胞對兩種生物型的牛病毒性腹瀉/黏膜病毒的敏感性鑒定：按照Reed-Muench方法計算顯示陽性的板孔中病毒半數致死量TCID₅₀，將病毒滴度均高于10⁶TCID₅₀/mL的細胞確定為對牛病毒性腹瀉/黏膜病毒敏感的MDBK細胞系。