[發明專利]一種牛篣苷元的制備方法

在審

• 申請號: 201610135720.8
• 申請日: 2016-03-10
• 公開（公告）號: CN105624258A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 蔣承建
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12P39/00
• 分類號: C12P39/00;C12P17/04;C12N1/14;C12R1/885;C12R1/665
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 梁濤

1.一種牛篣苷元的制備方法，其特征在于：本發明采用的發酵菌種為里氏木霉 (Trichodermareesei，CICC40932)和泡盛曲霉變種(Aspergillusawamorivar，CICC2203)；

所述的制備方法包括以下步驟：

(1)菌種活化：將處于真空干燥管內并低溫保存的菌種凍干粉取出后恢復至室溫，轉移至超 凈工作臺內，以沾有75％酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加熱外管尖端，滴數滴無菌水于 加熱處，使外管破裂，取出隔熱均勻涂布于PDA平板上，分離培養1～2d，培養溫度為28～30℃；

(2)制備種子菌液：將活化好的菌株接種于PDA平板上，置于恒溫培養箱內在28～30℃下 培養5～6d，加入無菌水至平板中晃動，沖下瓊脂表面的孢子，過濾，取得孢子懸浮液，計算 孢子濃度，并配制成孢子濃度為10⁶～10⁷個/mL的懸浮液，將孢子懸浮液按1：25的體積比置 于Mandel培養液中在28～30℃下培養1～2d即得種子菌液；

(3)牛蒡子粉的發酵炮制：將里氏木霉種子菌液和泡盛曲霉變種種子菌液按接種比為1:1～4， 接種量為1～5mL/110mL接種至發酵培養基中，在30℃下發酵培養36～168h，發酵完后向發酵 培養基中添加10mol/LNaOH至NaOH的質量分數為2％，終止發酵；

(4)牛蒡子粗提物的制備：在100℃下烘干發酵后的培養基并粉碎，將粉碎后的烘干制品置 于甲醇溶液中，并在功率80W，頻率為20kHz下超聲輻射20min，靜置8～12h后過濾并收集 濾液為牛蒡子粗提物溶液；

(5)純化：將硅膠，三氯甲烷充分溶脹后，濕法填入色譜柱，將牛蒡子粗提物溶液蒸干后溶 于三氯甲烷中，上樣，洗脫液為三氯甲烷：乙酸乙酯(v:v，10:2)，展開劑為氯仿：甲醇(v:v， 95:5)，將洗脫液濃縮干燥，將干燥物再次用硅膠柱層析純化，洗脫液改為三氯甲烷：乙酸乙 酯(v:v，6:1)，收集洗脫液，干燥結晶。

2.根據權利要求1所述的一種牛篣苷元的制備方法，其特征在于：所述的Mandel營養液由 磷酸二氫鉀2g，硫酸銨1.4g，尿素0.3g，硫酸鎂0.3g，氯化鈣0.3g，硫酸鐵5mg，硫酸錳1.56mg， 硫酸鋅1.4mg，氯化鈷0.2mg混合后，添加蒸餾水定容至1L，添加吐溫80、蛋白胨、葡萄糖 至吐溫80的濃度為2ml/L，蛋白胨的濃度為1ml/L，葡萄糖的濃度10ml/L，用硫酸調PH至 5.0～6.0，在115℃下滅菌20min制得。

3.根據權利要求1所述的一種牛篣苷元的制備方法，其特征在于：所述的發酵培養基的制備 方法為將牛蒡子粉、氮源、碳源裝入錐形瓶中在121℃下滅菌15min，然后加入無菌Mandel 營養液和無菌水，在121℃滅菌15min。

4.根據權利要求1或3所述的一種牛篣苷元的制備方法，其特征在于：所述的發酵培養基中 含有50～92％的牛蒡子粉，碳源與氮源比為100：2～14，Mandel營養液含量5～30ml/110ml， 發酵培養基的固液比為1:1.5～5，PH為4～7。

5.根據權利要求4所述的一種牛篣苷元的制備方法，其特征在于：所述的發酵培養基中，氮 源為蛋白胨、豆粕粉、尿素、(NH₄)₂SO₄、NH₄NO₃、NH₄CL的一種。

6.根據權利要求4所述的一種牛篣苷元的制備方法，其特征在于：所述的發酵培養基中，碳 源為玉米粉、麩皮和蔗糖的一種或幾種。