[發(fā)明專利]一種永生化毛囊干細(xì)胞系及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610134289.5
• 申請日: 2016-04-13
• 公開（公告）號: CN105695511A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李玉紅;星懿展;楊珂;郭海英
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 50219
• 代理人: 劉立春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種永生化毛囊干細(xì)胞系及其制備方法。

背景技術(shù)

干細(xì)胞的研究為再生醫(yī)學(xué)帶來了前所未有的前景。胚胎干細(xì)胞研究較成熟，但它的應(yīng)用 受到倫理的限制；誘導(dǎo)多能干細(xì)胞解決了倫理問題，卻面臨腫瘤威脅、誘導(dǎo)效率低等問題； 因此，對成體干細(xì)胞的研究仍然是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。毛囊干細(xì)胞(hairfolliclestem cell,HFSC)與其他成體干細(xì)胞相比，最大的特點(diǎn)是它本身就不斷經(jīng)歷著周期性的活化與靜 息，同時，毛囊干細(xì)胞位于皮膚，獲取方便。毛囊干細(xì)胞的這些特性使毛囊干細(xì)胞成為干細(xì) 胞與再生醫(yī)學(xué)研究的理想模型。

研究發(fā)現(xiàn)，毛囊干細(xì)胞除了參與毛囊的周期性再生外，還參與皮膚的創(chuàng)傷修復(fù)。而且， 有研究者甚至發(fā)現(xiàn)毛囊干細(xì)胞能夠幫助損傷神經(jīng)或脊髓的修復(fù)，并且能誘導(dǎo)分化為具有功能 的心肌細(xì)胞。因此，毛囊干細(xì)胞具有廣泛的應(yīng)用前景。

無論利用毛囊干細(xì)胞進(jìn)行基礎(chǔ)研究，還是進(jìn)行應(yīng)用研究，毛囊干細(xì)胞的大量獲取都是關(guān) 鍵因素。

現(xiàn)有技術(shù)中存在如下技術(shù)問題：目前毛囊干細(xì)胞的獲取方式一般通過解剖顯微鏡分離培 養(yǎng)或者進(jìn)行流式細(xì)胞儀、磁珠分選儀的分離培養(yǎng)原代細(xì)胞。這些方法獲得的毛囊干細(xì)胞的缺 點(diǎn)是，隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，毛囊干細(xì)胞逐漸失去其干性(即分化形成完整毛囊的能力)，而 且，這種毛囊干細(xì)胞無法長期傳代培養(yǎng)。現(xiàn)有方法如果需要獲得足夠?qū)嶒炑芯可踔僚R床使用 的毛囊干細(xì)胞，需要耗費(fèi)巨量的勞動力成本及經(jīng)濟(jì)成本。因此，迫切需要一種可以長期培養(yǎng)， 而仍然保持其干性的毛囊干細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容

針對以上上述現(xiàn)有技術(shù)問題和發(fā)明目的，本發(fā)明提出一種永生化毛囊干細(xì)胞系的制備方 法，包括如下步驟：

(1)分離培養(yǎng)原代小鼠毛囊干細(xì)胞；

(2)生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液；

(3)建立永生化毛囊干細(xì)胞系：

(3-1)接種原代毛囊干細(xì)胞；

(3-2)在步驟(2)收集的病毒上清液中加入聚凝胺；

(3-3)細(xì)胞貼壁后，吸掉培養(yǎng)基，加入含聚凝胺的病毒上清液；

(3-4)間隔一定時間更換新的含聚凝胺的病毒上清液；

(3-5)在第2輪換液時，加入潮霉素篩選；

(3-6)篩選3-5輪后，終止篩選，常規(guī)培養(yǎng)；

(3-7)篩選好的細(xì)胞即為永生化的毛囊干細(xì)胞。

進(jìn)一步地，步驟(3)中具體步驟如下：

(3-1)在直徑6cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種原代毛囊干細(xì)胞，起始密度為30-60％融合；

(3-2)在前面收集的病毒上清液中加入聚凝胺，使終濃度為5-20ug/ml；

(3-3)細(xì)胞貼壁后，吸掉培養(yǎng)基，加入3ml含聚凝胺的病毒上清液；

(3-4)每8-12小時換新的含聚凝胺的病毒上清液；

(3-5)在第2輪換液時，加入終濃度為100-400ug/ml的潮霉素篩選；

(3-6)篩選4-5輪后，終止篩選，改用正常的毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；

(3-7)篩選好的細(xì)胞即為永生化的毛囊干細(xì)胞。

進(jìn)一步地，步驟(2)包括如下步驟：

(2-1)接種HEK293細(xì)胞；

(2-2)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑；

(2-3)充分混合轉(zhuǎn)染試劑后室溫放置；

(2-4)洗HEK293細(xì)胞，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基；

(2-5)加入上述混合后的轉(zhuǎn)染試劑；

(2-6)吸掉培養(yǎng)基，加含血清的培養(yǎng)基；

(2-7)在轉(zhuǎn)染后間隔一定時間分別收集病毒上清液，暫存。

進(jìn)一步地，步驟(2)具體采用如下步驟：

(2-1)在直徑6cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種HEK293細(xì)胞，起始密度為30-60％融合；

(2-2)接種6-8小時后，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑：500ulDMEM培養(yǎng)基，10ulpAmpho質(zhì)粒，10 ul含SV40T抗原的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒，10-20ul脂質(zhì)體；

(2-3)充分混合轉(zhuǎn)染試劑后，室溫放置20分鐘；

(2-4)用無血清的DMEM培養(yǎng)基洗HEK293細(xì)胞3遍，加入2ml無血清的DMEM培養(yǎng)基；

(2-5)加入上述混合后的轉(zhuǎn)染試劑；