[發(fā)明專利]一種永生化毛囊干細胞系及其制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610134289.5
• 申請日: 2016-04-13
• 公開（公告）號: CN105695511A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發(fā)明（設計）人: 李玉紅;星懿展;楊珂;郭海英
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產權代理有限公司 50219
• 代理人: 劉立春

1.一種永生化毛囊干細胞系的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)分離培養(yǎng)原代小鼠毛囊干細胞；

(2)生產逆轉錄病毒上清液；

(3)建立永生化毛囊干細胞系：

(3-1)接種原代毛囊干細胞；

(3-2)在步驟(2)收集的病毒上清液中加入聚凝胺；

(3-3)細胞貼壁后，吸掉培養(yǎng)基，加入含聚凝胺的病毒上清液；

(3-4)間隔一定時間更換新的含聚凝胺的病毒上清液；

(3-5)在第2輪換液時，加入潮霉素篩選；

(3-6)篩選3-5輪后，終止篩選，常規(guī)培養(yǎng)；

(3-7)篩選好的細胞即為永生化的毛囊干細胞。

2.如權利要求1所述的永生化毛囊干細胞系的制備方法，其特征在于，步驟(3)中具體步 驟如下：

(3-1)在直徑6cm的細胞培養(yǎng)皿中接種原代毛囊干細胞，起始密度為30-60％融合；

(3-2)在前面收集的病毒上清液中加入聚凝胺，使終濃度為5-20ug/ml；

(3-3)細胞貼壁后，吸掉培養(yǎng)基，加入3ml含聚凝胺的病毒上清液；

(3-4)每8-12小時換新的含聚凝胺的病毒上清液；

(3-5)在第2輪換液時，加入終濃度為100-400ug/ml的潮霉素篩選；

(3-6)篩選4-5輪后，終止篩選，改用正常的毛囊干細胞培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；

(3-7)篩選好的細胞即為永生化的毛囊干細胞。

3.如權利要求1或2所述的永生化毛囊干細胞系的制備方法，其特征在于，步驟(2)包括 如下步驟：

(2-1)接種HEK293細胞；

(2-2)準備轉染試劑；

(2-3)充分混合轉染試劑后室溫放置；

(2-4)洗HEK293細胞，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基；

(2-5)加入上述混合后的轉染試劑；

(2-6)吸掉培養(yǎng)基，加含血清的培養(yǎng)基；

(2-7)在轉染后間隔一定時間分別收集病毒上清液，暫存。

4.如權利要求3所述的永生化毛囊干細胞系的制備方法，其特征在于，步驟(2)具體采用 如下步驟：

(2-1)在直徑6cm的細胞培養(yǎng)皿中接種HEK293細胞，起始密度為30-60％融合；

(2-2)接種6-8小時后，準備轉染試劑：500ulDMEM培養(yǎng)基，10ulpAmpho質粒，5-10 ul含SV40T抗原的逆轉錄病毒載體質粒，10-20ul脂質體；

(2-3)充分混合轉染試劑后，室溫放置20分鐘；

(2-4)用無血清的DMEM培養(yǎng)基洗HEK293細胞3遍，加入2ml無血清的DMEM培養(yǎng)基；

(2-5)加入上述混合后的轉染試劑；

(2-6)3-5小時后，吸掉培養(yǎng)基，加3ml含血清的培養(yǎng)基；

(2-7)在轉染后的24小時，48小時，72小時，96小時分別收集病毒上清液，暫存于4 度冰箱。

5.如權利要求1-4中任一項所述的永生化毛囊干細胞系的制備方法，其特征在于，進一步包 括步驟(4)：鑒定永生化毛囊干細胞系。

6.如權利要求5所述的永生化毛囊干細胞系的制備方法，其特征在于，步驟(4)中包括如 下步驟：

(4-1)細胞傳代能力鑒定；

(4-2)形態(tài)學鑒定；

(4-3)標記物鑒定；

(4-4)生物學鑒定。

7.如權利要求6所述的永生化毛囊干細胞系的制備方法，其特征在于，步驟(4-1)中，按 常規(guī)培養(yǎng)方法對永生化的毛囊干細胞進行反復傳代，在細胞傳代至第40代時，仍具有良 好的生長能力，取傳至第40代的永生化的毛囊干細胞進行進一步鑒定。

8.如權利要求6或7所述的永生化毛囊干細胞系的制備方法，其特征在于，步驟(4-2)中， 永生化的毛囊干細胞在傳代40代后，仍具有克隆樣生長的特性。