[發(fā)明專利]真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610132667.6
• 申請(qǐng)日: 2016-03-09
• 公開（公告）號(hào): CN105695473B
• 公開（公告）日: 2020-02-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 易守軍;曾云龍;陳佳鑫;林雨歡;鄧克勤;黃昊文;夏曉東;唐春然
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/115
• 分類號(hào): C12N15/115;G01N33/53;G01N21/64
• 代理公司: 湘潭市匯智專利事務(wù)所(普通合伙) 43108
• 代理人: 冷玉萍

本發(fā)明公開一種真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒。該方法包括：先將DONApt與單鏈信號(hào)探針ssDNA雜交，形成DONApt?ssDNA雜交鏈；然后向其加入待測(cè)樣品，當(dāng)待測(cè)樣品存在DON時(shí)，DONApt?ssDNA與DON反應(yīng)生成DONApt?DON，并釋放ssDNA；體系中剩余DONApt?ssDNA雜交鏈經(jīng)DNA擴(kuò)增形成雙鏈DNA；雙鏈DNA在外切酶催化下水解成單核苷酸除去，而體系中ssDNA被保留；再向體系中加入銀離子和還原劑，在ssDNA誘導(dǎo)下，銀離子還原生成近紅外熒光銀納米簇；最后依據(jù)近紅外熒光強(qiáng)度與DON的量的關(guān)系，計(jì)算待測(cè)樣品中的DON含量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及納米生物傳感以及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種真菌霉素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又稱嘔吐毒素，是一種B型單端孢霉烯族化合物，主要由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌產(chǎn)生，多分布于小麥、大麥、玉米等谷物籽實(shí)中，也污染糧食制品。DON對(duì)人畜可以產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng)，屬于劇毒或中等毒物，可致嘔吐、腹瀉、發(fā)燒等急性中毒癥狀，與貧血、免疫抑制、食管癌、克山病也具有密切聯(lián)系，另外，它還常與其它的霉鹵毒素如黃曲霉毒素共同污染農(nóng)作物，進(jìn)入人體后可以相互影響。DON是世界性的，特別是在中國(guó)、日本、美國(guó)、阿根廷、南非。在我國(guó)是胃癌、食管癌等惡性腫瘤高發(fā)區(qū)居民飲食中的主要污染霉菌毒素之一。如我國(guó)林縣、磁縣主要糧食面粉和玉米中的DON檢出率分別為53.8％和100％，林縣樣品(玉米)中DON平均含量為384～9686ng/g；磁縣霉菌污染更為嚴(yán)重，DON平均含量在玉米中為7959ng/g，面粉中為1032ng/g。因此糧食及制品中DON的含量監(jiān)控意義重大。

目前檢測(cè)DON的方法主要有薄層色譜、酶聯(lián)免疫、氣相色譜、液相色譜、免疫分析等，色譜法對(duì)操作技術(shù)要求高，檢測(cè)成本較高，免疫法需要使用價(jià)格較昂貴的酶、抗體等生化試劑，而且這些生化試劑存在容易失活等不足。其中酶聯(lián)免疫法(ELISA)具有快速、方便、預(yù)處理簡(jiǎn)捷等優(yōu)點(diǎn)，但ELISA的所需DON高效、特異的單抗或多抗制備工藝復(fù)雜，所用抗體普遍存在與DON的乙酰化類似物的交叉反應(yīng)，易出現(xiàn)假陽(yáng)性；專利CN 102559686A公開了一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體并應(yīng)用于DON的檢測(cè)，該法用于DON檢測(cè)具有高選擇性和快速的特點(diǎn)，但需要用到價(jià)格昂貴的修飾的DNA。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的高選擇性真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測(cè)方法，該方法主要包括以下步驟：

(1)將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體DONApt與單鏈信號(hào)探針ssDNA雜交，形成DONAp-ssDNA雜交鏈；

(2)向DONApt-ssDNA雜交鏈溶液體系中加入待測(cè)樣品，當(dāng)待測(cè)樣品中有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇DON存在時(shí)，DONApt-ssDNA雜交鏈選擇性地與DON反應(yīng)生成DONApt-DON，同時(shí)釋放出單鏈信號(hào)探針ssDNA；

(3)消除體系中剩余雜交鏈的干擾：DONApt-ssDNA雜交鏈經(jīng)DNA擴(kuò)增，形成雙鏈DNA；雙鏈DNA在核酸外切酶III選擇性地催化作用下，迅速水解成單核苷酸而除去；體系中單鏈信號(hào)探針ssDNA不水解而被保留下來(lái)；

(4)向體系中加入檸檬酸鈉、銀離子溶液和還原劑，若體系中有單鏈信號(hào)探針檢ssDNA存在，則銀離子被誘導(dǎo)生成被ssDNA修飾的近紅外熒光銀納米簇(DONApt-DON不能誘導(dǎo)銀離子還原成近紅外熒光銀納米簇，只有單鏈信號(hào)探針ssDNA能誘導(dǎo)生成具有強(qiáng)熒光的近紅外銀納米簇)；

(5)測(cè)定體系中近紅外熒光強(qiáng)度，根據(jù)近紅外熒光強(qiáng)度與DON濃度的關(guān)系計(jì)算待測(cè)樣品中的DON的含量。

上述的先后添加的檸檬酸鈉、銀離子和使銀離子迅速還原成近紅外熒光銀納米簇的還原劑維生素C構(gòu)成銀離子還原檢測(cè)體系。