[發(fā)明專利]真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測方法及檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610132667.6
• 申請日: 2016-03-09
• 公開（公告）號: CN105695473B
• 公開（公告）日: 2020-02-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 易守軍;曾云龍;陳佳鑫;林雨歡;鄧克勤;黃昊文;夏曉東;唐春然
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南科技大學(xué)
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/53;G01N21/64
• 代理公司: 湘潭市匯智專利事務(wù)所(普通合伙) 43108
• 代理人: 冷玉萍

1.一種非診斷目的的真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體DONApt與單鏈信號探針ssDNA雜交，形成DONApt-ssDNA雜交鏈；

（2）向DONApt-ssDNA雜交鏈體系中加入待測樣品中，當(dāng)待測樣品中有DON時，DONApt-ssDNA雜交鏈中DONApt的部分能選擇性地與DON反應(yīng),生成DONApt- DON，同時釋放出單鏈信號探針ssDNA；

（3）體系中剩余的DONApt-ssDNA雜交鏈經(jīng)DNA擴(kuò)增，形成雙鏈DNA，雙鏈DNA在核酸外切酶III選擇性地催化作用下水解成單核苷酸而除去，體系中單鏈信號探針ssDNA被保留下來；

（4）制備近紅外銀納米簇：向該體系中加入檸檬酸鈉、銀離子溶液和還原劑，單鏈信號探針ssDNA誘導(dǎo)銀離子還原生成強熒光的近紅外銀納米簇；

（5）檢測體系的近紅外熒光強度，根據(jù)近紅外熒光強度與DON濃度的關(guān)系計算待測樣品中的DON的含量；

所述的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體DONApt為5’-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTA AGGAAGTGCCCGGAGGCGGTATCGTGTGAAGTGC-3’；

所述的單鏈信號探針ssDNA為5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACTTCACACGATA-3’；

步驟（1）所述的雜交，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體DONApt與單鏈信號探針ssDNA的物質(zhì)的量之比為1：1；雜交前先分別配成各自的Tris-HCl溶液，然后在85~95℃加熱5~10分鐘后立即置于冰浴中處理5~10分鐘，Tris-HCl溶液的濃度50 mmol/L，pH為7.5；雜交溫度為37℃，時間為1小時以上；

步驟（2）中，DONApt-ssDNA雜交鏈的物質(zhì)的量大于待測樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇DON的物質(zhì)的量；

步驟（3）的擴(kuò)增水解，具體為：在步驟（2）所得反應(yīng)液中依次加入擴(kuò)增緩沖溶液、dNTP溶液和Phi29 DNA 聚合酶溶液，混勻后反應(yīng)10~20分鐘，再加入NH₄F -NaCl和Exo III核酸外切酶溶液，在37℃下繼續(xù)反應(yīng)20~30分鐘；擴(kuò)增緩沖溶液、dNTP溶液、Phi29 DNA 聚合酶溶液、 NH₄F-NaCl溶液、Exo III的體積比為10：18：2：10：2，擴(kuò)增緩沖溶液由50mM Tris-HCl,10 mM MgCl₂和10 mM (NH₄)₂SO₄組成，pH 為7.5，dNTP溶液的濃度為10 mM， Phi29 DNA 聚合酶溶液的濃度為10 u/μl， NH₄F-NaCl溶液由50 mM的NH₄F溶液與0.2M的NaCl溶液等體積混合而成，Exo III溶液的濃度為20 u/μL；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體DONApt、Phi29DNA 聚合酶、Exo III的配比為120 nmol：20u：40u；

步驟（4）的還原具體為：在步驟（3）所得反應(yīng)液中加入硝酸銀溶液和檸檬酸鈉緩沖液，再在室溫下避光或暗室中放置10~15分鐘后，快速攪拌下加入還原劑溶液，然后在45℃下反應(yīng)5~10分鐘；硝酸銀溶液、檸檬酸鈉緩沖液、還原劑的體積比為1：10：6；檸檬酸鈉緩沖液的濃度為10 mmol/L，pH為 8；還原劑為維生素C溶液，濃度為1mmol/L，pH為 8；硝酸銀溶液與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體DONApt的配比為0.5 mmol：3 μmol。