[發明專利]一種野生稻莖尖的超低溫保存及恢復培養方法

有效

• 申請號: 201610131944.1
• 申請日: 2016-03-09
• 公開（公告）號: CN105746351B
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發明（設計）人: 林田;楊華;王飛;魏士偉;張前榮;王國軍;石群芳;李天菲;龍萍;羅利軍
• 申請（專利權）人: 上海市農業生物基因中心
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01N3/00
• 代理公司: 上海智力專利商標事務所(普通合伙) 31105
• 代理人: 周濤

一種野生稻莖尖的超低溫保存及恢復培養方法，步驟有：取繼代培養無菌組培苗，留基部放入不含激素MS培養基內培養，切離基部新萌植株，轉入含0.3molL^?1蔗糖和脫落酸0.5?5mgL^?1培養基上培養，再轉入0.7molL^?1和含脫落酸0.5?5mgL^?1培養基上預培養，剝取莖尖，在0.4 molL^?1蔗糖和甘油2moL^?1MS固體培養基預培養，在2?4%的無鈣離子海藻酸鈉溶液中輕蘸，放在裝載條上，再浸入含有0.1?0.3%氯化鈣、0.4 molL^?1蔗糖和2moL^?1甘油MS液體培養基中，經固定后，吸去多余液體，置于預處理溶液中處理，再轉入玻璃化保護劑PVS2中進行冰浴處理，然后投入液氮中保存。其有益效果是，保存方法簡便易行，穩定可靠，保存后野生稻恢復生長狀況良好。

技術領域

本發明涉及一種野生稻莖尖的保存方法，具體的說，涉及一種普通野生稻莖尖的超低溫保存方法。同時，本發明還涉及到野生稻莖尖的超低溫保存后的恢復培養方法，屬于植物細胞工程技術領域。

背景技術

野生稻資源是稻種資源的重要組成部份, 它保存了栽培水稻沒有或已經消失了的基因, 并具有特殊的優良性狀及高抗病蟲害的特性，其有利基因的發掘和保存，對提高水稻產量和品質具有不可估量的價值。當前迅速惡化的環境和不利的氣候條件正在侵蝕著水稻的遺傳多樣性；人類現代急速擴張的經濟活動，導致了野生稻生境喪失及惡化、棲息地急劇減少；此外野生稻又具有柱頭外露、異交結實率較高、種子落粒性強的生物學特性。這些因素使野生稻種面臨滅絕的危險, 對野生稻遺傳多樣性的保護刻不容緩。目前，對野生稻的保護措施主要有就地保護和遷地保護，即以種子保存的種質厙、以種莖保存的種質圃。

植物組織與細胞的培養為植物的種質保存開辟了新的途徑，組織培養物能迅速大量繁殖, 再生植株可保持原有的遺傳特性。而超低溫保存（-196℃）下，植物的生物化學活性近乎停止，貯藏過程中的生理和遺傳變化能夠控制在最低限度內，避免了田間保存易受自然災害影響而導致種質變異或毀滅，以及組織培養保存中因多次繼代引起遺傳性狀變異或污染的危險，被認為是植物遺傳資源長期保存的最優選擇。

關于植物超低溫保存的研究，保存技術的多樣化與簡易化方面不斷取得進步，能夠保存的植物物種數也在不斷地增長，但多數集中在蘋果、櫻桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及馬鈴薯、紅薯、草莓等經濟植物為主的植物遺傳資源的超低溫保存。水稻的超低溫保存自1979年Sala等首先報道水稻懸浮細胞的超低溫保存后，相關研究多集中在組織培養物如懸浮細胞系、愈傷組織、原生質體及胚狀體上，關于水稻完整器官（如莖尖）凍存的報道僅見章志宏教授等在2000年采用程序降溫法對水稻單倍體幼穗離體培養誘導的不定芽進行超低溫保存，得到再生植株。野生稻的超低溫保存技術相關報道更少且集中于國內，如殷曉輝教授等1996年在普通野生稻、寬葉野生稻以及瘤粒野生稻愈傷組織超低溫保存研究中首次獲得了凍后再生植株，實驗證明了野生稻幼穗離體培養物的超低溫保存是稻屬資源保存的有效途徑。譚光軒教授等采用程序降溫法對野生稻幼穗離體培養誘導植株，直接進行超低溫保存，避開愈傷組織階段減少遺傳變異的危險，但產生的綠芽一周后白化死亡。

野生稻完整器官的凍存，將是今后研究的重點，但由于野生稻莖尖分生組織體積小、由于野生稻的莖尖組織具有細小、幼嫩的特點，生理狀態脆弱，且被外部護葉層層緊密包裹，在莖尖剝取、預培養及玻璃化凍存操作中容易折斷及受到傷害，保存中難以成活。同時，在其后的恢復培養中也不易再生或產生白化苗。采用程序降溫的冷凍方法對設備要求較高。

發明內容

由于現有技術中存在野生稻莖尖分生組織體積小、生理狀態脆弱，保存中難以成活的現象。本發明的目的是提供一種野生稻莖尖的超低溫保存方法，同時還提供一種野生稻莖尖超低溫保存方法后解凍恢復培養方法。

為了實現本發明的目的，本發明提供了一種野生稻莖尖的超低溫保存方法，包括如下步驟：