[發明專利]一種野生稻莖尖的超低溫保存及恢復培養方法

有效

• 申請號: 201610131944.1
• 申請日: 2016-03-09
• 公開（公告）號: CN105746351B
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發明（設計）人: 林田;楊華;王飛;魏士偉;張前榮;王國軍;石群芳;李天菲;龍萍;羅利軍
• 申請（專利權）人: 上海市農業生物基因中心
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01N3/00
• 代理公司: 上海智力專利商標事務所(普通合伙) 31105
• 代理人: 周濤

1.一種野生稻莖尖的超低溫保存方法，其特征在于，所述保存方法包括如下步驟：

步驟a:取繼代培養3個月以上的無菌組培苗，剪去上部植株，留基部放入不含激素的MS培養基內進行培養，所述步驟a中的繼代3個月以上無菌組培苗，剪去上部植株，留基部約3cm，根部約1cm放入不含激素的MS 培養基；

步驟b:通過步驟a培養5-7天后，將基部新萌植株切離后，帶基部轉入含0.3mol·L^-1的蔗糖和脫落酸0.5-5mg·L^-1的培養基上培養，所述步驟b中的基部新萌芽的長度為0.5-1cm；

步驟c:經過步驟b培養7-10天后的植株，再轉入0.7mol·L^-1蔗糖和含脫落酸0.5-5mg·L^-1的培養基上預培養3-7天；

步驟d:經過步驟c預培養3-7天后的植株在解剖鏡下剝取2-3mm的莖尖，在含有0.4mol·L^-1蔗糖及甘油2mol·L^-1的MS固體培養基上預培養16小時，所述MS固體培養基中不含NH₄⁺；

步驟e:用鑷子將經過步驟d預培養后的莖尖在2-4%的無鈣離子海藻酸鈉溶液中輕蘸，然后整齊放在5mm×20mm金屬網狀裝載條上，每條裝載條上5-10個莖尖；

步驟f:將帶莖尖的裝載條浸入含有0.1-0.3%氯化鈣、0.4 mol·L^-1蔗糖和2mol·L^-1甘油的MS液體培養基中，經10-30min固定后，將裝載條在無菌濾紙上吸去多余液體，所述MS液體培養基中不含NH₄⁺，

步驟g:將固定好的帶莖尖的裝載條放于預處理溶液中在室溫下處理20-60min后，轉入玻璃化保護劑PVS2中進行2-5小時的冰浴處理，將帶莖尖的裝載條迅速投入液氮中保存，其中，所述預處理溶液含有0.4 mol·L^-1蔗糖及甘油2mol·L^-1，不含NH₄⁺的MS液體培養基，所述玻璃化保護劑PVS2不含NH₄⁺。

2.一種野生稻超低溫保存后的恢復培養方法，其特征在于，所述野生稻經過超低溫保存方法保存過，解凍時從液氮中取出帶莖尖的裝載條，立即放入1.2mol·L^-1的1/2MS液體培養基中快速解凍2min，并在培養基中洗滌20min，所述1.2mol·L^-1的1/2MS液體培養基不含NH₄⁺，將帶莖尖的裝載條在濾紙上吸干后置于不含激素的1/2MS培養基中暗培養1天，然后在解剖鏡下將莖尖逐一由裝載條剝離，轉移到含BA及NAA的培養基上進行暗培養，所述含BA及NAA的培養基不含NH₄⁺，經過處理過的莖尖再生后轉入含BA及NAA的培養基光照培養，所述莖尖再生后轉入含BA及NAA的培養基含NH₄⁺。