[發明專利]抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗體及應用該抗體的免疫層析試劑盒

有效

• 申請號: 201610129801.7
• 申請日: 2016-03-08
• 公開（公告）號: CN105585633B
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發明（設計）人: 胡征;董俊;楊波
• 申請（專利權）人: 湖北工業大學;湖北華龍生物制藥有限公司
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;G01N33/569;G01N33/558;G01N33/532
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 余曉雪;王敏鋒

1.一種基于抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗體所形成的免疫層析試劑盒，其特征在于：所述試劑盒是基于量子點標記技術的免疫層析試劑盒或基于膠體金標記技術的免疫層析試劑盒；

所述抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗體包括AbP6A及AbP6B，所述AbP6A及AbP6B的制備方法是：

1)經結構生物學分析及相關實驗研究后，選定人流感嗜血桿菌P6蛋白62-75位的14個氨基酸及115-128位的14氨基酸組成的短肽分別作為制備兔抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗體的兩個線性抗原表位，該兩段氨基酸序列分別為VLVEGNTDERGTPE及LGHDEAAYSKNRRA，將此二序列分別命名為P6A及P6B，所述人流感嗜血桿菌P6蛋白在GenBank中的序列號是AGH02799.1；

2)將步驟1)所述的氨基酸序列P6A的N端、P6B的N端分別添加一個半胱氨酸后，用多肽自動合成儀分別合成多肽并純化，純化后的兩條多肽分別與載體蛋白KLH偶聯，形成P6A-KLH復合蛋白及P6B-KLH復合蛋白；

3)分別將步驟2)所合成的兩種復合蛋白乳化，乳化后分別在兔腹部皮下多點注射，先后注射三次，每次間隔7-10天；

4)第三次注射10-12天后，分別收集、分離得到兩種含有兔抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗體的血清，ELISA分別檢測血清中兔抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗體的效價，所述的兩種兔抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗體的效價均在1：60000以上；

5)將步驟2)合成并純化的兩條多肽分別與溴化氰活化的Sepharose4B偶聯，形成兩組多肽親和層析柱；

6)將步驟4)獲得的兩種含有兔抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗體的血清分別對應的加入到步驟5)制備的兩種親和層析柱中，并在4℃孵育過夜后，洗脫抗體，得到兩種兔抗人流感嗜血桿菌P6蛋白抗體；經SDS-PAGE鑒定其純度均在97％以上，將這兩種純化的抗體分別命名為AbP6A及AbP6B；

上述試劑盒是基于量子點標記技術的免疫層析試劑盒時，所述試劑盒的制備方法是：

1)量子點標記抗體AbP6A溶液：

向微量離心管中依次加入0.4nmol羧基水溶性量子點和800nmol碳二亞胺EDC，以MES緩沖液定容為1ml，混合溶液，37℃反應5min后，再加入0.34mg的制備得到的抗體AbP6A，避光反應2h，加入單端氨基聚乙二醇PEG2000-NH2至終濃度為1％m/v，封閉未反應的活化羧基位點，繼續避光反應1h；反應后的樣品用超濾管離心，6500g離心5min，至體積200ul，將超濾后樣品轉移至普通EP管內，離心除團聚，得到上部清液以及下部沉淀，10000g條件下離心3min；將上部清液加到分離柱Superdex-200上純化，待上部清液自然流入柱體中，然后用PBS沖洗，用紫外光照射柱體觀察樣品的位置，待樣品開始從下部流出時開始收集，收集1ml后停止收集；將純化后的樣品用超濾管以6500g離心濃縮至200ul后轉移至普通EP管內離心除團聚，對普通EP管進行離心的條件是10000g，3min；獲取上清后以磷酸鹽保存液稀釋200倍，4℃保存備用；至此制得量子點標記抗體AbP6A溶液；

所述MES緩沖液中各組分含量分別是：10.66g/L MES以及0.74g/L EDTA，所述MES緩沖液的pH7.4；

所述磷酸鹽保存液的制備方式是稱取0.29g磷酸氫二鈉、0.0295g磷酸二氫鈉、0.2g氯化鈉、1g牛血清白蛋白BSA以及0.1gNaN₃，溶解于90ml的去離子水中，用1mol/L NaOH調pH至7.3后用去離子水定容至100ml；

2)制備結合墊

將聚酯纖維膜浸入步驟1)所得到的量子點標記抗體AbP6A溶液中1h，取出，25℃干燥后裁成后規格為4cm×0.6cm/條后，4℃密封保存備用，至此制得結合墊；

3)制備樣品墊

取玻璃纖維素膜一張，將玻璃纖維素膜在樣品墊處理液中浸泡至少3h，再置于生物安全柜內37℃通風干燥后，剪裁成規格為4cm×2.5cm/條后，即制得樣品墊，25℃密封保存；

所述樣品墊處理液的制備方式是稱取0.29g磷酸氫二鈉、0.0295g磷酸二氫鈉、0.2g氯化鈉、2g牛血清白蛋白BSA、1ml吐溫-20、2g蔗糖以及0.5g聚乙烯吡咯烷酮PVP-10，溶解于90ml的去離子水中，用1mol/L NaOH調pH至7.3后用去離子水定容至100ml；

4)制備檢測層

將硝酸纖維素膜剪成4cm×4cm大小；將制備得到的抗體AbP6B和羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調整至終濃度分別為2.0mg/mL及1.0mg/mL；將稀釋好的抗體AbP6B裝入BIODOT劃膜儀噴頭中，設置1.0μl/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測線；將稀釋好的抗兔IgG裝入BIODOT劃膜儀噴頭中，設置1.0μl/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質控線，質控線與檢測線間距為0.7cm；將噴好的硝酸纖維素膜37℃干燥2h，剪裁成4cm×4cm的規格，4℃密封干燥保存；至此制得檢測層；

所述磷酸鹽緩沖液的制備方式是：稱取0.29g磷酸氫二鈉、0.0295g磷酸二氫鈉以及0.2g氯化鈉，溶解于90ml的去離子水中，用1mol/L NaOH調pH至7.3后用去離子水定容至100ml；

5)組裝檢測卡

5.1)將底板裁剪成4cm×7.3cm大小，備用；

5.2)將吸水濾紙裁剪成4cm×3cm大小，作為吸水墊，備用；

5.3)將步驟5.1)制備得到的底板上的粘性保護膜揭掉，將步驟4)所述的檢測層即帶有質控線和檢測線的硝酸纖維素膜粘貼到底板上，并抹平膜面；

5.4)將步驟5.2)準備好的吸水墊組裝到底板上，使吸水墊的左邊與檢測層右末端有0.2cm的重疊，吸水墊的右邊緣則與底板的右邊緣對齊粘好并抹平；再將步驟2)所描述的結合墊按0.3cm重疊于檢測層的左邊緣處，0.3cm粘于底板上；

5.5)將步驟3)所描述的樣品墊則按一邊0.3cm重疊于結合墊的左邊緣處，另一邊與底板的左邊緣對齊，粘于底板上并抹平；將組裝好的檢測板于切條機下裁成4.0mm寬的檢測卡，4℃密封干燥避光保存；

上述試劑盒是基于膠體金標記技術的免疫層析試劑盒時，所述試劑盒的制備方法是：

1)膠體金標記抗體AbP6A

1.1)制備30nm膠體金溶液：

取一個硅化好的250ml三角瓶，加入99ml超純水，將1ml1％m/v HAuCl₄溶液加入250ml三角瓶中并與超純水混勻，油浴加熱并攪拌至沸騰；向250ml三角瓶中快速加入2ml1％m/v檸檬酸三鈉水溶液，溶液繼續沸騰10min，待250ml三角瓶中的溶液由藍色轉變為紅色時停止加熱，將250ml三角瓶中的溶液自然冷卻至室溫，然后向250ml三角瓶中加入超純水補齊至100ml；

1.2)膠體金標記抗體AbP6A：

1.2.1)取一個硅化好的50ml三角瓶，加入10ml步驟1.1)所制備的膠體金溶液，向膠體金液中加入240ul0.2mol/L K₂CO₃調節pH至8.5；

1.2.2)在電磁攪拌器攪拌下，將抗體AbP6A加入膠體金溶液中，至抗體終濃度為10ug/ml，加入抗體時逐滴加入，加完后繼續攪拌45min～60min；

1.2.3)反應完成加入2.5ml5％m/v牛血清白蛋白BSA至終濃度為1％m/v，攪拌15～30分鐘，4℃保存備用；

1.2.4)將標記好的抗體AbP6A取出后裝入50ml離心管,2500g，4℃離心5分鐘，得到下層沉淀及上層清液，棄掉下層沉淀，上層清液轉移至另一只50ml離心管，12000g，4℃離心30分鐘，得到下層沉淀及上層清液，棄掉上層清液，將下層沉淀用10ml膠體金緩沖液重懸沉淀，然后再12000g，4℃離心30分鐘，再次得到下層沉淀及上層清液，將下層沉淀最后用3ml膠體金緩沖液重懸，4℃保存備用；

所述膠體金緩沖液中各組分含量分別是：10mM Tris、1％m/v BSA、1％v/vTween-20、5％m/v蔗糖以及3‰m/v聚乙烯吡咯烷酮，所述膠體金緩沖液的pH為10.5；

2)制備結合墊

將聚酯纖維膜浸入步驟1)所得到的膠體金標記抗體AbP6A溶液中1h，取出，25℃干燥后裁成后規格為4cm×0.6cm/條后，4℃密封保存備用，至此制得結合墊；

3)制備樣品墊

取玻璃纖維素膜一張，將玻璃纖維素膜在樣品墊處理液中浸泡至少2h，再置于生物安全柜內37℃通風干燥后，剪裁成規格為4cm×1.5cm/條后，即制得樣品墊，25℃密封保存；

所述樣品墊處理液的制備方式是稱取0.242g Tris、1g牛血清白蛋白BSA、1ml吐溫-20、5g蔗糖以及0.3g聚乙烯吡咯烷酮PVP-10，溶解于90ml的去離子水中，用1mol/L NaOH調pH至11后用去離子水定容至100ml；

4)制備檢測層

將硝酸纖維素膜剪成4cm×2cm大小；將制備得到的抗體AbP6B和羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調整至終濃度分別為2.0mg/mL及1.0mg/mL；將稀釋好的抗體AbP6B裝入BIODOT劃膜儀噴頭中，設置1.0μl/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測線；將稀釋好的抗兔IgG裝入BIODOT劃膜儀噴頭中，設置1.0μl/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質控線，質控線與檢測線間距為0.5cm；將噴好的硝酸纖維素膜37℃干燥18h，剪裁成4cm×2cm的規格，4℃密封干燥保存；至此制得檢測層；

所述磷酸鹽緩沖液的制備方式是：稱取0.29g磷酸氫二鈉、0.0295g磷酸二氫鈉以及0.2g氯化鈉，溶解于90ml的去離子水中，用1mol/L NaOH調pH至7.3后用去離子水定容至100ml；

5)組裝檢測卡

5.1)將底板裁剪成4cm×6cm大小，備用；

5.2)將吸水濾紙裁剪成4cm×2.5cm大小，作為吸水墊，備用；

5.3)將步驟5.1)制備得到的底板上的粘性保護膜揭掉，將步驟4)所述的檢測層即帶有質控線和檢測線的硝酸纖維素膜粘貼到底板上，并抹平膜面；

5.4)將步驟5.2)準備好的吸水墊組裝到底板上，使吸水墊的左邊與檢測層右末端有0.2cm的重疊，吸水墊的右邊緣則與底板的右邊緣對齊粘好并抹平；再將步驟2)所述的結合墊按0.2cm重疊于檢測層的左邊緣處，0.4cm粘于底板上；

5.5)將步驟3)所述的樣品墊則按一邊0.2cm重疊于結合墊的左邊緣處，另一邊與底板的左邊緣對齊，粘于底板上并抹平；將組裝好的檢測板于切條機下裁成4.0mm寬的檢測卡，4℃密封干燥避光保存。