[發明專利]一種通過生物催化生產磷酸肌酸的方法

有效

• 申請號: 201610128871.0
• 申請日: 2016-03-08
• 公開（公告）號: CN105671096B
• 公開（公告）日: 2019-05-07
• 發明（設計）人: 傅榮昭;張琦
• 申請（專利權）人: 邦泰生物工程(深圳)有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12P13/00
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• 代理人: 暫無信息

一種通過生物催化生產磷酸肌酸的方法，涉及磷酸肌酸的制備方法的技術領域。本發明提供的方法主要解決磷酸肌酸現有的生物催化生產方法產率低、成本高的技術問題，該方法具體為以肌酸和三磷酸腺苷為底物，在肌酸激酶突變體的催化作用下生產磷酸肌酸，所述肌酸激酶突變體具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，該氨基酸序列的特點是將肌酸激酶親本的氨基酸序列中第33位點的Val突變為Ala。該肌酸激酶突變體的比活性較肌酸激酶親本高出80%，該方法使肌酸轉化為磷酸肌酸的轉化率超過85%，適于大規模工業化生產。

技術領域

本發明涉及磷酸肌酸的制備方法的技術領域，特別涉及一種利用生物酶催化技術生產磷酸肌酸的生物催化方法。

背景技術

磷酸肌酸(phosphocreatine)是在肌肉或其他可興奮組織(如腦和神經)中的一種高能磷酸化合物，是高能磷酸基的暫時貯存形式。磷酸肌酸的作用非常多，其主要作用有以下七點：(1)心肌保護劑：磷酸肌酸廣泛地分布于身體各組織，90％在肌肉組織中，磷酸肌酸是用來維持ATP水平的，磷酸肌酸通過開放合成通路和減少分解作用，保護肌纖維膜免受缺血損害并維持細胞的核酸儲備。臨床用于心麻痹癥的心臟保護及心肌代謝窘迫的其他狀況。適用于心肌缺血、肥厚、心梗及心衰的治療(輔助治療)，亦可用作各種心臟手術；(2)緩沖肌肉中酸性物質突然增高；(3)磷酸肌酸(CP)還參與能量運輸，即把能量從線粒體運載到肌肉的其它部位；(4)運動員首選的運補劑：磷酸肌酸對于增加運動員的體能，提高運動成績有明顯的效果、安全有效，無副作用。在比賽中，磷酸肌酸(CP)水平的增加能提高訓練和比賽成績；(5)ATP的貯存形式：磷酸肌酸可以把高能磷酸轉移給ADP生成ATP,因此磷酸肌酸是ATP的貯存形式；(6)與ADP作用而產生ATP：當體內肌酸磷酸激酶降低至零之前,腦組織缺氧時，磷酸肌酸均能與ADP作用而產生ATP；(7)緩沖劑的作用：磷酸肌酸除提供能量外，在大強度練習中還可以對控制肌肉中的酸性物質起緩沖劑的作用，這是因為磷酸肌酸在合成ATP過程中需要消耗大強度練習中堆積在肌肉中乳酸釋放出來的氫離子，而肌肉中氫離子過多會阻礙肌肉收縮，所以磷酸肌酸能起緩沖作用并推遲疲勞的出現。

現有技術中，磷酸肌酸的生產方法包括化學合成法和生物催化法。化學合成法具有反應條件苛刻、激烈、不易控制，生成產物復雜，污染環境，合成過程中需要用到有毒且易燃的原料等缺點；而生物催化法則是以肌酸和ATP為底物，在肌酸激酶的催化下，專一生成磷酸肌酸，具有反應條件溫和、反應速度快、專一性強及低碳環保等優點。但是，由于肌酸激酶的活力較低，且來源受限，致使磷酸肌酸的生產成本過高，嚴重制約了磷酸肌酸生物催化法的規?；彤a業化生產。

發明內容

針對上述背景技術中提到的磷酸肌酸現有生產方法存在的缺陷，本發明的目的在于提供一種產率高、成本低、適于大規模工業化生產的磷酸肌酸的生物催化生產方法。

為實現上述目的，發明人對具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的Oryctolaguscuniculus肌酸激酶親本基因進行定點突變，PCR擴增后插入適當的載體，隨后在LB培養基上篩選，從而獲得了具有高催化活性的肌酸激酶突變體，因此，本發明提供了一種通過生物催化生產磷酸肌酸的方法，其特征在于：以肌酸和三磷酸腺苷為底物，在肌酸激酶突變體的催化作用下生產磷酸肌酸，所述肌酸激酶突變體具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

上述肌酸激酶突變體可以是未經純化的粗酶形式；也可以是經部分純化或完全純化的酶，純化過程可采用常規的Histag法；如果需要，還可以是利用固化技術制成的固相酶或者固相細胞形式的固化酶。

優選地，所述肌酸與所述三磷酸腺苷的摩爾比為20:1。

優選地，所述催化過程還需加入MgCl₂和三聚磷酸鈉。

優選地，所述催化過程是在pH值為7～8的緩沖溶液中進行。

所述緩沖溶液優選為Tris-HCl緩沖溶液。