[發明專利]一種三維細胞模型的構建方法

在審

• 申請號: 201610128744.0
• 申請日: 2016-03-08
• 公開（公告）號: CN105671029A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 萬香波
• 申請（專利權）人: 萬香波;范新娟
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N5/00
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;宋靜娜

技術領域

本發明涉及一種細胞培養模型的構建方法，尤其是一種三維細胞培養模型 的構建方法。

背景技術

目前，腫瘤相關的基礎研究大多建立在二維細胞培養基礎上，其特點是簡 便易操作，易于研究單細胞的表型變化。但是此類研究卻難以從腫瘤組織的立 體結構特點上模擬體內細胞的組織微環境，故而無法準確反映腫瘤細胞在三維 空間組織中的表型特點。

三維細胞培養作為有別于傳統二維平板細胞培養的嶄新的細胞培養模式， 能在體外最大限度地反映體內細胞微環境的結構基礎：1)可較真實地反映腫瘤 在體內的發生過程：細胞通過其表面的特異性受體特別是整合素家族受體實現 細胞與細胞之間以及細胞與基質之間的病理聯系及信號傳導；2)可再現腫瘤組 織中細胞內及細胞間的信號通路蛋白及關鍵生命分子表達的動態演變過程。因 而，三維細胞培養應用于腫瘤表型研究具有獨特的優勢。

三維細胞培養技術在國際上正處于發展完善階段，并在研究腫瘤細胞轉化、 轉移及放化療敏感性的分子機制方面顯示出光明的應用前景。常規的三維細胞 培養過程為：1)將基質膠培養基(Matrigel)從-20℃中取出后置于冰上，半小時 后基質膠將由固態轉變為液態；2).在特定的三維細胞培養小室中將基質膠鋪就 呈穹窿型；3).室溫放置半小時至一小時基質膠將由液態恢復固態，加入細胞培 養基并接種腫瘤細胞后置于細胞培養箱中培養一至兩周后檢測。申請人基于此 模型的放療敏感性研究發現，鼻咽癌細胞CNE-2在基質膠培養基中形成巨大畸 形球狀實體，當予以小分子抑制劑VX-680及X線放射處理后，激光共聚焦熒 光染色顯示CNE-2細胞團內P53及P21表達上調并誘導CNE-2三維細胞團發生 凋亡(CleavedCaspase-3表達明顯升高)，隨后細胞團松散--猶如體內反射線處 理后腫瘤組織的消退過程(結果已發表于國際腫瘤學期刊CancerBiology& Therapy，2009,8(15):1500-1506.)

目前，三維細胞模型構建過程中主要存在以下問題：(1)三維細胞模型難 以構建：首先需要構建猶如穹窿狀的基質膠團塊，基質膠反復凍融后難以形成 穹窿狀，即便是首次使用的嶄新的基質膠，其穹窿狀塑形亦需非常嫻熟的技巧， 而一旦穹窿狀塑形不佳，如出現偏心或塌陷，將直接導致后續檢測過程難度的 加大，甚至無法檢測；如出現三維基質膠培養模型與培養小室四壁接觸，則會 直接導致模型構建失敗而無法進行后續試驗。(2)構建后培養成型時間長：常 規情況下腫瘤細胞在基質膠上需要約7-14天方能形成球型空間結構。(3)檢測 難度大：常規基質膠在培養基中浸泡一周后易出現膨脹軟化，因而在后續三維 免疫熒光染色時非常易于出現三維基質膠碎裂，進而無法完成后續染色及三維 重建。

導致現有三維細胞模型構成過程中的問題的原因主要有以下幾個方面：(a) 常規手工方法塑形的不均一性：傳統三維模型構建與操作者的熟練程度密切相 關，但是由于人為因素常造成三維培養模型的不均一性，具體表現為：外形不 均一(偏心、塌陷)及三維模型內部不均一(主要由于塑形凝固過程中基質膠 的流動造成)。(b)塑形失敗：常規手工方法塑形時易發生基質膠與培養小室四 壁接觸的情況，而一旦發生接觸，由于液體張力原因，基質膠迅速流向培養小 室四壁，形成四周高中間低的“碗狀”構型，導致塑形失敗。此種情況在手工 塑形過程中極易發生，成為塑形失敗的重要原因之一。(c)檢測困難：基于基 質膠的三維細胞培養模型需要浸泡在培養基中生長7-14天，基質膠經過一周的 浸泡后極易出現膨脹軟化及碎裂，在后續三維免疫染色時非常容易出現模型破 裂變形等問題，影響檢測。

發明內容

本發明的內容在于克服上述現有技術的不足之處而提供一種容易實現、所 需時間較短，且構建成的三維細胞模型結構緊密、不易散開、穩定性優良的三 維細胞模型構建方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：一種三維細胞模型的構建方 法，包括以下步驟：

(1)將細胞種植于含有培養基的培養皿中，然后將鐵磁性納米顆粒加入到 培養基中并混勻，培養至細胞密度達到80～90％，得到含有鐵磁性納米顆粒的細 胞；

(2)將步驟(1)所得含有鐵磁性納米顆粒的細胞重新種植于含有培養基 的培養皿中，在培養皿的上方放置與所述培養皿嵌合的磁力控制裝置，然后培 養18～36小時，即得三維細胞模型；