[發明專利]雞白血病內源病毒ev21分子標記及其引物、鑒定方法、應用

有效

• 申請號: 201610127019.1
• 申請日: 2016-03-07
• 公開（公告）號: CN105671202B
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發明（設計）人: 李蘭會;張秀玲;李祥龍;張樂超;劉春楊;臧素敏;周榮艷
• 申請（專利權）人: 河北農業大學;河北科技師范學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 李進

本發明涉及分子遺傳學領域，具體而言，涉及一種雞白血病內源病毒ev21分子標記及其引物，該引物的正向引物為：5’GGAGGGAGACTATTTTTACACG3’；反向引物為：5’GTTTAACGGACCAACAGGCTAGTCTCTCG’。該引物特異性好，擴增效率高，擴增產物中包含6614bp的ev21基因序列。本發明還提供了一種雞白血病內源病毒ev21的分子鑒定方法，該方法與上述引物配合進行實驗，操作簡便，可行性高，利用該方法還可以用于快慢羽種雞內源白血病病毒ev21的分子凈化或某些品種雞的快慢羽表型鑒定。

技術領域

本發明涉及分子遺傳學領域，具體而言，涉及一種雞白血病內源病毒ev21分子標記及其引物、鑒定方法、應用。

背景技術

禽白血病病毒(Avian leukosis viruses，ALVs)是引起禽類各種造血細胞腫瘤性增生的一類逆轉錄酶病毒。針對雞的ALVs共有六種亞型(A、B、C、D、E和J)。E型白血病病毒(ALVE)屬雞內源性病毒(endogenous virus，EV)，其完整的或部分的遺傳序列元件整合于雞細胞染色體基因組中，隨雞基因組復制而復制，遵循孟德爾遺傳規律，具備潛在的影響雞體生理功能的作用。ev21是ALVE的一種，其轉錄活化影響外源病毒的感染和疾病發生，并影響蛋品生產、蛋重和蛋比重等重要經濟性狀。

現已證明雞攜帶有超過50種不同的ALVE內源病毒位點，其中22種ALVE位點來自于白萊航雞體內。每只蛋雞一般攜帶有1～3個ALVE位點，而每只肉雞有8～10個。之前的研究認為，ev21基因與慢羽雞K基因連鎖(Smith&Crittenden 1986；Bacon et al.1988)，慢羽雞和快羽雞的雜交實驗發現ev21與K基因間距0.3cM(Smith&Fadly 1994)。慢羽白萊航雞及其后代均表現出對外源淋巴白血病病毒免疫性能減退、生產性能下降、死亡率升高等(Harriset at，1984；Smith and Fadly，1988)，這些癥狀可能都與ev21相關。寧中華等也證實了白殼蛋雞慢羽系的ALV高發生率與內源病毒ev21的存在有直接關系，并對蛋雞的生產性能產生影響。

九十年代研究者利用Southern-blot技術來檢測，即通過制備病毒特異DNA片斷及其側翼區域的特異探針利用DNA雜交和RFLP技術檢測ALVE病毒元件，該技術基于病毒插入位點上下游的雞基因組序列特異性通過限制內切酶獲得不同長度基因片斷而鑒定的。由于Southern-blot技術成本較高，且費時，現在一般應用基于位點特異性的PCR技術鑒別。之前也有研究通過PCR獲得390bp或515bp序列以鑒定ev21的存在，但由于ev21基因序列全長為7524bp，擴增難度很大，因而只有相對小的測序序列被成功擴增，未見有獲得較完整病毒基因組序列的報道，這對于ev21的研究帶來很多的阻礙。此外，由于之前的擴增均只擴增出了ev21的一小部分，而ev21具有重復序列，且其插入區和LTR具有多態性，因而關于其基因序列與慢羽雞K基因連鎖的報道可能存在錯誤。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種雞白血病內源病毒ev21的分子標記，該標記中含有ev21基因中的6614bp序列，占ev21基因全長的88％左右，用此標記可檢測雞體內是否攜帶ev21基因。

本發明的第二目的在于提供一種雞白血病內源病毒ev21的分子鑒定引物，該引物特異性好，擴增效率高，可用于白萊航雞快慢羽表型的分子鑒定。

本發明的第三目的在于提供一種雞白血病內源病毒ev21的分子鑒定方法，該方法可以擴增出如上所述的分子標記。

本發明的第四目的在于提供一種雞白血病內源病毒ev21的分子鑒定方法在快慢羽種雞內源白血病病毒ev21的分子凈化中的應用，配合本申請特定的引物及其擴展方法。該方法比其他的現有的PCR技術鑒定結果都更為準確，可排除快慢羽種雞白血病病毒ev21攜帶者，建立用于羽速性別鑒定的慢羽純種蛋雞品系，對蛋雞品種選育生產具有重大意義。