[發明專利]一種適用流式細胞術進行小麥根尖細胞周期分析的方法

在審

• 申請號: 201610126581.2
• 申請日: 2016-03-07
• 公開（公告）號: CN105784573A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 岳潔瑜;王利;談論語
• 申請（專利權）人: 天津師范大學
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

本發明得到國家自然基金青年項目（31501234）的資助。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及用流式細胞術進行小麥根尖細胞周期（G1期，S期，G2/M期）的分析方法。

背景技術

流式細胞儀（FlowCytometer，FCM）是以激光技術、光電測量技術、計算機技術、流動力學技術、電子物理、細胞免疫熒光化學技術以及單克隆抗體技術為一體的新型高科技儀器。它可以在單細胞水平上進行定性、定量分析及分選，主要應用于血液學、免疫學、腫瘤學、分子生物學和細胞生物學等學科的基礎研究及臨床試驗中。相對于動物和微生物而言，由于植物組織與細胞結構復雜（如細胞壁、特殊細胞器等），制備適合流式細胞儀分析的單細胞懸浮液比較困難，流式細胞儀在在植物學領域的應用相對比較滯后。但隨著流式樣品制備技術的不斷更新，流式細胞術在植物科學領域如植物遺傳育種、植物染色體分析與文庫構建、逆境植物學、植物分類學、植物病理學等各個學科中顯示出廣闊的應用前景。

用流式細胞儀檢測樣本時，要求樣本必須是完整的細胞或細胞核的懸浮液。并且細胞核的濃度也要達到一定的要求。由于植物細胞具有細胞壁外，并且含有大量次生代謝物，這就給制備樣本增加了難度，大大降低了流式實驗的成功率。而且不同的植物結構和成分有較大的差異，所以在制備細胞核懸浮液上方法不同，通常所用的的細胞核制備方法有直接剪切法和酶解法。目前在植物學研究中，主要通過制備植物單細胞核懸液進行流式細胞分析，從而檢測植物細胞核DNA含量及染色體倍性。盡管已在玉米、甘薯、獼猴桃、小麥等植物上利用流式細胞術進行了細胞核DNA含量的研究，但這些研究均是用不同解離液提取這些植物不同組織細胞的細胞核時，雜質和樣品碎片較多，易與細胞核聚成團，并且非離子去垢劑的濃度難以把握，破壞細胞膜的同時也易破壞核膜，這樣就造成提取的細胞核數目少。

植物生長在自然環境中,必然受到各種外界環境的刺激作用，植物響應外界環境的變化一直是生物學關心的課題。植物的生長發育就是植物細胞的生長和分裂，而植物細胞周期的變化與其生長發育密切相關。小麥作為重要的糧食作物之一，研究小麥的細胞周期，具有非常重要的現實意義。已有研究表明，和動物細胞一樣，植物細胞存在復雜的細胞周期調控機理，從而影響植物的生長發育本研究在前人研究的基礎上，通過改進制備出完整的、形態較好、不粘連的小麥單細胞，再利用熒光染料DAPI對小麥根尖細胞進行核酸染色，根據核酸結合量確定細胞周期，使用流式細胞儀將不同DNA含量的周期時相，如G1期，S期，G2/M期，加以區分和計數，了解細胞的增殖情況，為進一步做分子生物學研究奠定基礎。本方法建立了完整可行的試驗方法，操作步驟簡單，試驗效果穩定、清晰，因此無論是在科研、檢測以及學生試驗中都能得到很好的應用。

發明內容

本發明以小麥根尖作為實驗材料制備單細胞懸液，再利用流式細胞儀檢測其細胞周期變化，意義在于為進一步研究小麥生長發育及小麥響應環境變化效應的分子機制提供技術支撐。

為實現上述目的，本發明公開如下技術方案如下：

1、一種適用流式細胞術進行小麥根尖細胞周期分析的方法，它是利用固定好的小麥根尖樣品，制備小麥根尖組織的單細胞懸浮液，進行熒光染色，流式細胞儀檢測，包括：

（1）小麥種子進行浸種催芽，待根長長至3-5cm時，切取約0.2cm長度的根尖，固定于新鮮配制的卡諾氏固定液中30min，用pH7-8的磷酸緩沖液漂洗干凈后再轉入體積比為70％的乙醇中，保存于4℃冰箱；所述的卡諾氏固定液指的是：甲醇:冰乙酸的體積比為3:l；其特征在于：

（2）將固定好的根尖樣品置入0.1－0.2％（v/v）的甘油中滲透2-3h，用pH7-8的磷酸緩沖液漂洗3次，每次10min，靜置沉淀后用移液槍吸取上層緩沖液，再浸沒于纖維素酶和果膠酶制成的混合酶液中，37℃酶解1.5-3h，使小麥根尖組織松軟；所述的纖維素酶和果膠酶的質量濃度皆為2%，用去離子水配制；

（3）將所述步驟2）中的小麥根尖用pH7-8的磷酸緩沖液漂洗3次，每次10min，用移液槍吸取大部分上層緩沖液后，用研棒溫和研磨成單細胞懸液，過濾，收集濾液，即可獲得單細胞懸液.目前，在植物上通常是提取植物組織細胞的細胞核，提取液成分復雜，雜質和碎片易于細胞核聚集成團，難于分離，本發明用常規試劑制成的單細胞懸液雜質碎片少，更易于后續實驗操作。