[發明專利]一種轉化生產α-苯丙酮酸效率提高的重組菌

有效

• 申請號: 201610126110.1
• 申請日: 2016-03-05
• 公開（公告）號: CN105647846B
• 公開（公告）日: 2019-04-23
• 發明（設計）人: 堵國成;劉龍;陳堅;李江華;侯穎
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/40;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 耿曉岳

本發明公開了一種轉化生產α?苯丙酮酸效率提高的重組菌，屬于生物技術領域。本發明成功實現了大腸桿菌內L?氨基酸脫氨酶和鹵化酶的共表達，提高了輔酶再生，PPA的產量可達18.3g/L。此全細胞轉化體系的建立，解決了化學法合成PPA的步驟繁瑣、得率低、污染環境等問題及酶法轉化生產PPA的轉化率低的問題，實現了無污染、高產率、一步法生產PPA，為后續工業化生產奠定了一定的理論基礎。

技術領域

本發明涉及一種轉化生產α-苯丙酮酸效率提高的重組菌，屬于生物技術領域。

背景技術

α-苯丙酮酸(PPA)有很多應用，可用來合成抗腫瘤藥物的雜環化合物，可作為抗氧化劑及促進傷口愈合。目前PPA生產主要是化學合成法，這些方法均需經過多步反應，對反應條件有較高要求，易產生有毒有害產物。酶和全細胞生物催化劑越來越多的用于工業化生產。

L-氨基酸脫氨酶(EC1.4.3.2)催化L-氨基酸氧化脫氨基，生成相應α-酮酸和氨。Proteus mirabilis KCTC2566中L-氨基酸脫氨酶具有廣泛的底物特異性，能夠催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其對L-苯丙氨酸具有較高催化活性。

全細胞轉化相比分離酶具有很多優勢，如易制備，更穩定，無污染，副產物少。通過構建表達來源于P.mirabilis KCTC2566的脫氨酶基因的大腸桿菌，并以之為全細胞催化劑轉化L-苯丙氨酸生產PPA，PPA的產量可以達到10.0g/L。但是，這個全細胞催化的氧化脫氨基反應需要輔酶FAD作為電子載體，FAD的胞內再生系統需要多酶催化，效率低；而FAD價格昂貴，不宜外源添加，因此需要構建一種一步再生系統，以促進轉化效率。

現有的FAD再生系統包括電化學再生、化學再生、酶法再生，這些方法的缺陷是生成H₂O₂、酶失活、選擇性低、共底物有毒性等。因此需要一種溫和、簡單、低成本、高效率的FAD再生方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種轉化生產α-苯丙酮酸效率提高的重組菌，通過加強重組大腸桿菌的輔酶FAD再生系統，從而提高全細胞轉化L-苯丙氨酸生產苯丙酮酸的產量和效率。

所述重組菌是共表達L-氨基酸脫氨酶和鹵化酶的大腸桿菌。

在本發明的一種實施方式中，編碼所述L-氨基酸脫氨酶的基因aad的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發明的一種實施方式中，編碼所述鹵化酶的基因rebH的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本發明的一種實施方式中，以表達載體pRSFDuet-1共表達L-氨基酸脫氨酶和鹵化酶。

在本發明的一種實施方式中，以大腸桿菌BL21(DE3)為表達宿主。

在本發明的一種實施方式中，所述重組菌的構建是通過PCR擴增rebH和aad，克隆到質粒pRSFDuet-1，構建重組質粒pRSFDuet-AAD-RebH，重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，構建重組大腸桿菌全細胞催化劑。

本發明還提供一種應用所述重組菌轉化生產α-苯丙酮酸的方法，是將重組菌作為全細胞催化劑。

在本發明的一種實施方式中，是將L-苯丙氨酸20-30g/L、全細胞催化劑4-6g/L、L-色氨酸1-2g/L，在pH 8.0的0.9％的NaCl溶液中，于36-37℃、200-220rpm轉化6-10h。

在本發明的一種實施方式中，所述是全細胞催化劑的獲得，是將重組菌培養后誘導其表達L-氨基酸脫氨酶和鹵化酶，進一步收集重組菌菌體得到。