[發明專利]一種轉化生產α-苯丙酮酸效率提高的重組菌

有效

• 申請號: 201610126110.1
• 申請日: 2016-03-05
• 公開（公告）號: CN105647846B
• 公開（公告）日: 2019-04-23
• 發明（設計）人: 堵國成;劉龍;陳堅;李江華;侯穎
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/40;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 耿曉岳

1.一種轉化生產α-苯丙酮酸效率提高的重組菌，其特征在于，是以大腸桿菌BL21(DE3)為表達宿主，以表達載體pRSFDuet-1共表達L-氨基酸脫氨酶和鹵化酶，加強輔酶FAD再生；編碼所述L-氨基酸脫氨酶的基因aad的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；編碼所述鹵化酶的基因rebH的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一種構建權利要求1所述重組菌的方法，其特征在于，PCR擴增編碼L-氨基酸脫氨酶和鹵化酶的基因，克隆到質粒pRSFDuet-1，構建重組質粒pRSFDuet-AAD-RebH，重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌。

3.一種應用權利要求1所述重組菌轉化生產α-苯丙酮酸的方法，其特征在于，將重組菌作為全細胞催化劑。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，是將L-苯丙氨酸20-30g/L、全細胞催化劑4-6g/L、L-色氨酸1-2g/L，在pH 8.0的0.9％的NaCl溶液中，于36-37℃、200-220rpm轉化6-10h。

5.根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述全細胞催化劑是通過培養重組菌使其表達L-氨基酸脫氨酶和鹵化酶，進一步收集重組菌菌體得到的。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，將重組大腸桿菌按1-2％接種量到50mL發酵培養基中，37℃培養，當OD₆₀₀達到0.6-0.8，加入0.4mM IPTG誘導L-氨基酸脫氨酶和鹵化酶表達，28℃誘導24h后，8000rpm低溫離心10-15min，收集菌體，用pH為8的20mM Tris-HCl緩沖液洗兩遍菌體即得。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，誘導重組菌發酵產酶的發酵培養基組成為：蛋白胨12g/100mL，酵母提取物24g/100mL，甘油4mL/100mL；各組分溶解后高壓滅菌，冷卻到60-80℃，再加100mL滅菌的17mmol/L KH₂PO₄和72mmol/L K₂HPO₄的溶液。