[發明專利]一種蘋果莖溝病毒檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201610125351.4
• 申請日: 2016-03-07
• 公開（公告）號: CN105648117A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 魏芳
• 申請（專利權）人: 魏芳
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及微生物檢測領域，具體地說，本發明涉及一種蘋果莖 溝病毒檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術

蘋果為世界四大水果之一，分布廣泛，具有很高的經濟價值，在 我國已有兩千多年的栽培歷史。目前，我國蘋果樹栽培面積和總產量 均居世界第一，但生產水平和果品質量仍與先進國家存在相當差距， 其影響因素很多，病毒病的危害是造成這一現象的重要原因之一。蘋 果病毒病在世界各地廣泛分布，影響嚴重，具有危害性強、傳播擴散 快和難以治愈的特點。樹體受到病毒危害后，病毒在寄主細胞內寄生 并增殖，破壞干擾樹體的正常生理機能，嚴重影響果樹的生長，降低 產量、品質、果品的耐貯藏性和耐運力，也影響蘋果根系對土壤營養 物質的吸收和利用，造成嚴重的經濟損失。

蘋果莖溝病毒(Applestemgroovingvirus,ASGV)是常見的潛隱 性病毒之一，危害蘋果、梨、柑橘、櫻桃、杏等果樹，可通過種子、 嫁接、機械接種、汁液摩擦等方式感染宿主，迄今尚未發現其傳播媒 介。被蘋果莖溝病毒侵染的果樹植株表現出嫁接部位壞死，葉片不同 程度變黃，后期出現大塊黑斑或卷葉等癥狀，病株較健康株生長矮小 并衰弱。由于其癥狀與其他常見病毒感染相比并無典型性，因此容易 被忽視。

蘋果莖溝病毒是發形病毒屬(Capillovirus)的代表性成員，其基 因組有兩個ORF：ORF1編碼分子量241KDa的多聚蛋白，CP位于 其C端，大小為27KDa；ORF2位于ORF1內部，編碼分子量為36KDa 的運動蛋白，運動蛋白與外殼蛋白部分基因重疊。目前對蘋果莖溝病 毒的檢測，多采用傳統生物學方法、血清學方法以及分子生物學方法。 然而，傳統方法耗時長，靈敏度不高，特異性差；血清學方法費用昂 貴，操作步驟多，耗時較長，且樣品中可能存在與抗體發生非特異性 反應的雜質，易出現假陽性結果，因此只適合于初篩；而分子生物學 方法由于其特異性強、靈敏度高，是現今應用最多的處于研究前沿的 方法。為了適應產業發展需求，有必要開發一種能夠更加快速、準確 地對蘋果莖溝病毒進行分子生物學檢測的方法。

環介導恒溫擴增技術(loop-mediatedisothermalamplification, LAMP)是近些年發展起來的一種新型的核酸擴增方法(見文獻 NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,YonekawaT,WatanabeK,Amino N,HaseT.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.Nucleic AcidsRes.2000Jun15；28(12):E63)。而逆轉錄-環介導恒溫擴增技術 (RT-LAMP)是基于LAMP建立的RNA檢測技術，其靈敏度是普通 RT-PCR的100倍。RT-LAMP擴增原理與LAMP相同，但在反應體 系中增加了逆轉錄酶，使RNA的逆轉錄和cDNA的LAMP擴增在同 一試管中一步完成。與常規PCR相比，RT-LAMP無需模板的熱變性、 溫度循環、電泳及紫外觀察等過程，短時間內即可實現大量拷貝數的 核酸擴增，且無需高端的儀器設備，具有特異性強、靈敏度高、易于 判讀、可定性定量等優勢。

發明內容

本發明的目的在于提供一種蘋果莖溝病毒檢測試劑盒及檢測方 法。

為了實現本發明的目的，在一個方面中，本發明提供了一種蘋果 莖溝病毒檢測試劑盒，其特征在于包括4條特異性引物：外引物F3， 其序列如SEQIDNO:1所示；外引物B3，其序列如SEQIDNO:2所 示；內引物FIP，其序列如SEQIDNO:3所示；內引物BIP，其序列 如SEQIDNO:4所示。引物序列具體如下：

外引物F3：TGTTCCTGAATTGAAAACCTT(SEQIDNO:1)

外引物B3：CAAAGTCAAATGCAACCCA(SEQIDNO:2)

內引物FIP：TCGGCAAAAGGCTCACAAAG-TACTTCTAGGC AAAATTCTTTGAAC(SEQIDNO:3)

內引物BIP：CTGGCACGTGAATTTCTTCATGA-TTCTCAAA TGCTTTGGGC(SEQIDNO:4)。

優選所述外引物F3和B3的濃度均為5pmol/μl，所述內引物FIP 和BIP的濃度均為40pmol/μl。