[發(fā)明專利]一種蘋果莖溝病毒檢測試劑盒及檢測方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201610125351.4 | 申請日： | 2016-03-07 |
| 公開（公告）號： | CN105648117A | 公開（公告）日： | 2016-06-08 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 魏芳 | 申請（專利權(quán)）人： | 魏芳 |
| 主分類號： | C12Q1/70 | 分類號： | C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 050011 河*** | 國省代碼： | 河北;13 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 蘋果 病毒 檢測 試劑盒 方法 | ||
1.一種蘋果莖溝病毒檢測試劑盒，其特征在于包括4條特異性 引物：外引物F3，其序列如SEQIDNO:1所示；外引物B3，其序列 如SEQIDNO:2所示；內(nèi)引物FIP，其序列如SEQIDNO:3所示；內(nèi) 引物BIP，其序列如SEQIDNO:4所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其進一步包括反應(yīng)緩沖液、 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、BstDNA聚合酶和核酸染料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中所述反應(yīng)緩沖液由10mM dNTP、10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液、5mM甜菜堿和50mMMgSO4組 成。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中所述核酸染料為SYBR GreenI。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其進一步包括RNA提取 試劑以及陽性對照和陰性對照。
6.一種蘋果莖溝病毒檢測方法，其包括以下步驟：
(1)提取待測樣品RNA；
(2)設(shè)計并合成引物；
(3)建立25μl的RT-LAMP反應(yīng)體系，其包括5pmol/μl的外引物 F31μl、5pmol/μl的外引物B31μl、40pmol/μl的內(nèi)引物FIP1μl、 40pmol/μl的內(nèi)引物BIP1μl、反應(yīng)緩沖液2.5μl、2UAMV逆轉(zhuǎn)錄酶1μl、 8UBstDNA聚合酶1μl、模板DNA2μl，加水補充至25μl，并以蘋果 莖溝病毒基因組DNA作為陽性對照，以100mMTris-HClpH8.0和 50mMEDTA作為陰性對照；
(4)LAMP反應(yīng)：將步驟(3)中PCR管于63℃恒溫反應(yīng)60min；
(5)分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果：在(4)中所得反應(yīng)產(chǎn)物中加入1μl 核酸染料，根據(jù)反應(yīng)液的顏色判斷是否存在蘋果莖溝病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其中所述外引物F3的序列如 SEQIDNO:1所示，外引物B3的序列如SEQIDNO:2所示，內(nèi)引物FIP 的序列如SEQIDNO:3所示，內(nèi)引物BIP的序列如SEQIDNO:4所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蘋果莖溝病毒RT-LAMP檢測方法， 其中所述反應(yīng)緩沖液由10mMdNTP、10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液、 5mM甜菜堿和50mMMgSO4組成。
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