[發明專利]一種荷葉總生物堿對植物病原真菌抑制活性方法及應用

在審

• 申請號: 201610125125.6
• 申請日: 2016-03-04
• 公開（公告）號: CN105524976A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發明（設計）人: 肖桂青;盧向陽;魏琦超
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;A01N65/08;A01P3/00
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 裴娜

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，尤其涉及一種荷葉總生物堿對植 物病原真菌抑制活性方法及應用。

背景技術

荷葉為睡蓮科多年生水生草本植物蓮(NelumbonuciferaGaertn) 的葉片，又名蓮葉，藕葉。我國荷葉資源豐富，以長江、黃河和珠江 等三大流域分布最廣。傳統醫學認為，荷葉味苦、平，歸肝、脾、胃 經，具有清暑利濕、升發清陽、清心去熱、止血利水的活性。據《本 草綱目》記載“荷葉服之，令人瘦劣”、“生發元氣，稗助脾胃，澀 精濁，散淤血，消腫痛，發痘瘡”。在2003年3月中華人民共和國 衛生部的衛監發(2002)第51號文件中，荷葉被列入第2批“既是食 品又是藥品”的名單之中。目前，荷葉的臨床應用較多的是以復方的 形式用于減肥降脂。此外，荷葉金銀花口香糖通過在口香糖配料中加 入適量對口腔有保健作用的荷葉抑菌成分，以增加口香糖的保健功能。 荷葉化學成分復雜，除含有植物所共有的碳水化合物、脂質、蛋白質、 無機鹽和水等成分外，還含有生物堿、黃酮等多種生物活性成分。干 荷葉中總生物堿含量約為1.0％，主要為異喹啉類和阿樸啡類，并多 以去氫和甲基化兩種形態存在。研究發現，荷葉中生物堿類物質能干 擾微生物蛋白質的代謝，抑制紡錘體微管蛋白聚合，同時還能抑制 RNA聚合酶的活力，中斷細胞膜脂質的合成和氨基酸在細胞膜上的 轉運，使微生物的有絲分裂停止于中期，因此具有良好的抗菌作用。 如荷葉總生物堿具有明顯抑制細菌生長的作用，其單體鵝掌楸堿對大 腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為32μg/mL，杏 黃罌粟堿對紅色毛癬菌和石膏狀小孢子菌的MIC均為16μg/mL，O- 去甲基荷葉堿對金黃色葡萄球菌的抑制作用與氯霉素相當。在農作物 侵染性病害中，主要有真菌性病害和細菌性病害兩種，其中真菌性病 害約占病害的70～80％。一種作物上可發現幾種甚至幾十種真菌病 害。目前主要采取農藥噴施方法對其進行防治。由于大量農藥的使用 對環境和人畜造成了深遠而慘重的危害。因此，充分挖掘尚未得到合 理利用的資源，從植物中發現開發高效低毒的天然有效抗菌活性成分 成為一條重要途徑，符合綠色思維的發展潮流。

發明內容

本發明的目的在于提供一種荷葉總生物堿對植物病原真菌抑制 活性方法及應用，旨在解決目前主要采取農藥噴施方法對植物病原真 菌進行防治，大量農藥的使用對環境和人畜造成了深遠而慘重危害的 問題。

本發明是這樣實現的，一種荷葉總生物堿對植物病原真菌抑制活 性方法，所述荷葉總生物堿對植物病原真菌抑制活性方法包括：

孢子懸液的制備：將保存菌種接入馬鈴薯固體培養基的試管斜面 活化，取一支生長4d的試管斜面，用50mL的0.9％的無菌生理鹽水 倒入試管中，用無菌的玻棒在斜面上攪動，將孢子刮下來，并用兩層 紗布過濾，裝入三角瓶中，用血球板計數法和平皿計數法測定其生長 濁度，將孢子懸液稀釋；

經微波輔助熱回流法提取、D－101型大孔吸附樹脂純化、冷 凍干燥得到，其中荷葉堿含量為1.37％，取荷葉總生物堿固體適量， 溶解，配置總生物堿溶液，調節pH，將溶液用微量小濾器過濾除菌 后用于體外抑菌試驗；

采用管碟法。待培養基冷卻到50℃時，加入2mL孢子懸液，搖 勻，倒入直徑為12cm培養皿中，待凝固后，將牛津杯放置平皿菌層 上，每杯加入荷葉總生物堿，觀察抑菌圈的大小；

采用試管倍比稀釋法，分別用50％乙醇溶液置備荷葉總生物堿， 分別吸取以上濃度的荷葉總生物堿1mL加入到19mL液體培養基中， 再加入0.2mL孢子懸液，30℃培養48h，從試管中吸取0.2mL的培養 液，加入固體培養基中，涂布均勻，倒置放入30℃的恒溫培養箱中， 培養48h，觀察，未長菌平皿的最高稀釋濃度為荷葉總生物堿最低殺 菌濃度；

采用平皿倍比稀釋法，培養皿中加入19.0mL培養基，待培養基 還未凝固時，分別在各個培養皿中加入濃度為10mg/mL、5mg/mL、 2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.312mg/mL、0.16mg/mL 荷葉總生物堿溶液1.0mL，搖勻，同時以50％乙醇為對照，待培養凝 固后，向各平皿中加入0.2mL孢子懸液，涂布均勻，30℃倒置培養 48h，觀察，未長菌平皿的最高稀釋濃度為荷葉總生物堿的最低抑菌 濃度。