[發(fā)明專利]一種荷葉總生物堿對植物病原真菌抑制活性方法及應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610125125.6
• 申請日: 2016-03-04
• 公開（公告）號: CN105524976A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 肖桂青;盧向陽;魏琦超
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;A01N65/08;A01P3/00
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 裴娜

1.一種荷葉總生物堿對植物病原真菌抑制活性方法，其特征在 于，所述荷葉總生物堿對植物病原真菌抑制活性方法包括：

孢子懸液的制備：將保存菌種接入馬鈴薯固體培養(yǎng)基的試管斜面 活化，取一支生長4d的試管斜面，用50mL的0.9％的無菌生理鹽水 倒入試管中，用無菌的玻棒在斜面上攪動，將孢子刮下來，并用兩層 紗布過濾，裝入三角瓶中，用血球板計數(shù)法和平皿計數(shù)法測定其生長 濁度，將孢子懸液稀釋；

經(jīng)微波輔助熱回流法提取、D－101型大孔吸附樹脂純化、冷 凍干燥得到，其中荷葉堿含量為1.37％，取荷葉總生物堿固體適量， 溶解，配置總生物堿溶液，調(diào)節(jié)pH，將溶液用微量小濾器過濾除菌 后用于體外抑菌試驗；

采用管碟法，待培養(yǎng)基冷卻到50℃時，加入2mL孢子懸液，搖 勻，倒入直徑為12cm培養(yǎng)皿中，待凝固后，將牛津杯放置平皿菌層 上，每杯加入荷葉總生物堿，觀察抑菌圈的大小；

采用試管倍比稀釋法，分別用50％乙醇溶液置備荷葉總生物堿， 分別吸取以上濃度的荷葉總生物堿1mL加入到19mL液體培養(yǎng)基中， 再加入0.2mL孢子懸液，30℃培養(yǎng)48h，從試管中吸取0.2mL的培養(yǎng) 液，加入固體培養(yǎng)基中，涂布均勻，倒置放入30℃的恒溫培養(yǎng)箱中， 培養(yǎng)48h，觀察，未長菌平皿的最高稀釋濃度為荷葉總生物堿最低殺 菌濃度；

采用平皿倍比稀釋法，培養(yǎng)皿中加入19.0mL培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基 還未凝固時，分別在各個培養(yǎng)皿中加入濃度為10mg/mL、5mg/mL、 2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.312mg/mL、0.16mg/mL 荷葉總生物堿溶液1.0mL，搖勻，同時以50％乙醇為對照，待培養(yǎng)凝 固后，向各平皿中加入0.2mL孢子懸液，涂布均勻，30℃倒置培養(yǎng) 48h，觀察，未長菌平皿的最高稀釋濃度為荷葉總生物堿的最低抑菌 濃度。

2.如權(quán)利要求1所述的荷葉總生物堿對植物病原真菌抑制活性 方法，其特征在于，所述用血球板計數(shù)法和平皿計數(shù)法測定其生長濁 度，將孢子懸液稀釋到10⁵～10⁶cuf.·mL^-1。

3.如權(quán)利要求1所述的荷葉總生物堿對植物病原真菌抑制活性 方法，其特征在于，所述取荷葉總生物堿固體適量，用50％乙醇溶解， 配置成10mg/mL和50mg/mL總生物堿溶液，調(diào)節(jié)pH為8。

4.如權(quán)利要求1所述的荷葉總生物堿對植物病原真菌抑制活性 方法，其特征在于，所述每杯分別加入2mg/mL、4mg/mL、10mg/mL 荷葉總生物堿0.25mL，30℃恒溫培養(yǎng)48h，觀察抑菌圈的大小，抑菌 圈的評判標(biāo)準(zhǔn)為：d≤8mm為不敏感型，8mm＜d≤13mm為低度敏感 型,13mm＜d≤19mm為中度敏感型，d＞19mm為高度敏感型。

5.如權(quán)利要求1所述的荷葉總生物堿對植物病原真菌抑制活性 方法，其特征在于，所述采用試管倍比稀釋法，分別用50％乙醇溶液 置備10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、 0.32mg/mL、0.16mg/mL荷葉總生物堿。

6.一種如權(quán)利要求1-5任意一項荷葉總生物堿對植物病原真菌 抑制活性方法的稻瘟病菌抑菌活性應(yīng)用。

7.一種如權(quán)利要求1-5任意一項荷葉總生物堿對植物病原真菌 抑制活性方法的黃瓜枯萎病菌抑菌活性應(yīng)用，最低抑菌濃度和最低殺 菌濃度均為160μg/mL。

8.一種如權(quán)利要求1-5任意一項荷葉總生物堿對植物病原真菌 抑制活性方法的油菜菌核菌抑菌活性應(yīng)用。

9.一種如權(quán)利要求1-5任意一項荷葉總生物堿對植物病原真菌 抑制活性方法的紅菇根霉菌抑菌活性應(yīng)用。

10.一種如權(quán)利要求1-5任意一項荷葉總生物堿對植物病原真菌 抑制活性方法的小麥赤霉菌抑菌活性應(yīng)用。