[發明專利]一種用于靶向雜交捕獲的修飾性DNA雜交探針的制備方法

有效

• 申請號: 201610124516.6
• 申請日: 2016-03-04
• 公開（公告）號: CN105647907B
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發明（設計）人: 郎秋蕾;周小川;方超;殷楠楠;孟佳軍
• 申請（專利權）人: 杭州聯川生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏;趙越劍

本發明公開了一種用于靶向雜交捕獲的修飾性DNA雜交探針的制備方法主要方法為：制備DNA模板，PCR擴增，純化PCR產物；對純化后的PCR產物進行USER酶切割以及T4 DNA聚合酶末端平滑化，Lambda核酸外切酶水解產物的雙鏈DNA中一條帶有5′端磷酸化的單鏈，從而獲得帶有生物素標記的單鏈DNA；磁珠富集法純化帶有生物素標記的單鏈DNA，得修飾性DNA雜交探針。本發明極大了降低了生產成本、使用范圍廣，包括任意物種基因組的外顯子區域、內含子區域、線粒體區域以及內含子區域等。所獲得的DNA雜交探針可以應用于二代測序靶向文庫的構建以及測序。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及一種用于靶向雜交捕獲的修飾性DNA雜交探針的制備方法。

背景技術

2003年，人類基因組計劃獲得首張人類全基因組圖譜，這一成果引領開辟了基因組學分析、個體化醫療。伴隨著人類技術的革新，二代測序技術(Next GenerationSequencing)出現在人們的視野，它可以一次性完成數十萬到數百萬條DNA分子的序列測定，使得在極短時間內對基因組進行細致研究成為可能。大量研究表明，人類疾病特別是癌癥的產生與其個體相關基因的單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)有著顯著的相關性。盡管與傳統測序技術相比，下一代測序技術的成本大幅降低，但目前測序一套個人基因組圖譜仍然高達數萬人民幣，而由于受到測序深度的限制，幾乎無法提供指標意義判讀的數據。所以，在現階段，如何實現對大批量樣本的某個特定區域進行高通量平行靶向樣本制備并測序，確定和了解涉及人類疾病的遺傳變異，提高診斷、治療和預防疾病的能力，對許多科學和臨床醫學研究具有重大意義。

靶向測序文庫制備技術充分發揮了二代測序技術的潛能，與全基因組測序相比，富集后再測序大大降低了成本，減輕了后續數據分析的壓力，讓研究人員能夠充分利用二代測序的通量。由于存在著非常高的技術壁壘，目前幾種靶向富集方法主要包括以基于RNA：DNA核酸雜交層面上的靶向序列捕獲系統。其中基于微陣列芯片上合成制備寡核甘酸池，然后再進一步體外制備RNA探針，雖然在探針制備上具有極強的靈活性，但是RNA雜交捕獲探針不具有穩定性，需要嚴格的儲藏與運輸條件。同時由于所用的所使用的探針為RNA，需要極高的操作要求、試劑以及實驗器皿都需要是無RNA酶的。對于實驗操作人員的技術要求性極高。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于靶向雜交捕獲的修飾性DNA雜交探針的制備方法，無需RNA探針對于環境和操作的嚴格要求，又保留了RNA：DNA核酸分子極強結合能力的性能。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種用于靶向雜交捕獲的修飾性DNA雜交探針的制備方法，包括以下步驟：

(1)通過平行制備寡核苷酸池獲得包含目標序列以及通用引物區域的DNA模板；

(2)使用Taq聚合酶以及含有dUTP的PCR引物進行PCR反應，同時在PCR過程中引入生物素標記的ATP和甲基化dm⁵CTP；

(3)磁珠富集法純化PCR產物；

(4)對純化后的PCR產物進行USER酶切割以及T4DNA聚合酶末端平滑化；

(5)磁珠富集法純化步驟(4)處理后的產物；

(6)Lambda核酸外切酶水解步驟(5)純化后產物的雙鏈DNA中一條帶有5′端磷酸化的單鏈，從而獲得帶有生物素標記的單鏈DNA；

(7)磁珠富集法純化帶有生物素標記的單鏈DNA，得修飾性DNA雜交探針。