[發明專利]一種用于靶向雜交捕獲的修飾性DNA雜交探針的制備方法

有效

• 申請號: 201610124516.6
• 申請日: 2016-03-04
• 公開（公告）號: CN105647907B
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發明（設計）人: 郎秋蕾;周小川;方超;殷楠楠;孟佳軍
• 申請（專利權）人: 杭州聯川生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏;趙越劍

1.一種用于靶向雜交捕獲的修飾性DNA雜交探針的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)使用Taq聚合酶以及含有dUTP的PCR引物進行PCR反應，PCR反應體系如下：

在PCR儀中執行以下反應程序：

2)Beads純化PCR產物；

2.1)向每管PCR產物中加入3.5倍體積已充分混勻的beads并徹底混勻；

2.2)室溫孵育5min；

2.3)將反應管置于磁力架上至少3min或直至液體澄清；

2.4)將反應管留在磁力架上用移液槍吸取并棄掉上清；

2.5)保持反應管于磁力架上加入200μl 70％的乙醇溶液，靜置30s，然后用移液槍棄去乙醇；重復乙醇清洗步驟1次；

2.6)兩次乙醇清洗后，去除乙醇；將反應管置于室溫干燥5min；

2.7)干燥完成后，從磁力架上取下反應管并加入18μl Nulease-free water，充分混勻；

2.8)將反應管放回磁力架上直到液體澄清；收集上清液到新的管子中并進行下一步實驗；

3)對純化后的PCR產物進行USER酶切割以及T4DNA聚合酶末端平滑化；

3.1)準備以下反應：

3.2)將反應管置于預熱的PCR儀中，合上蓋子，37℃孵育15min；

3.3)保持反應管在PCR儀上，加入1μl 300U/ml的T4DNA聚合酶，1μl 1mM的dNTP，用移液槍吸取全部體積輕柔吹打6～8次充分混勻，繼續在PCR儀上孵育37℃，10min，然后將反應管置于冰上；

3.4)選作：取1ul稀釋10倍的PCR產物，采用高靈敏度DNA生物分析芯片電泳質檢判斷條帶大小；

4)Beads純化步驟3)產物；

4.1)向每管產物中加入3.5倍體積已充分混勻的beads并徹底混勻；

4.2)室溫孵育5min；

4.3)將反應管置于磁力架上至少3min或直至液體澄清；

4.4)將反應管留在磁力架上用移液槍吸取并棄掉上清；

4.5)保持反應管于磁力架上加入200ul 70％的乙醇溶液，靜置30s，然后用移液槍棄去乙醇；重復乙醇清洗步驟1次；

4.6)兩次乙醇清洗后，去除乙醇；將反應管置于室溫干燥5min；

4.7)干燥完成后，從磁力架上取下反應管并加入18μl Nulease-free water，充分混勻；

4.8)將反應管放回磁力架上直到液體澄清；收集上清液到新的管子中并進行下一步實驗；

5)Lambda核酸外切酶水解雙鏈DNA中5′端磷酸化的單鏈；

5.1)準備以下反應：

5.2)將反應管置于預熱的PCR中，合上蓋子，37℃孵育30min；之后將反應管置于冰上；

5.3)選作：取1μl稀釋10倍的PCR產物采用高靈敏度DNA生物分析芯片電泳質檢判斷條帶大小；

6)Beads純化單鏈DNA；

6.1)向每管產物中加入3.5倍體積已充分混勻的beads并徹底混勻；

6.2)向樣本-beads的混合液中加入100％的異丙醇并使其終濃度在20％，充分混勻；

6.3)室溫孵育5min；

6.4)將反應管置于磁力架上至少3min或直至液體澄清；

6.5)將反應管留在磁力架上用移液槍吸取并棄掉上清；

6.6)保持反應管于磁力架上加入200ul 70％的乙醇溶液，靜置30s，然后用移液槍棄去乙醇；重復乙醇清洗步驟1次；

6.7)兩次乙醇清洗后，去除乙醇；將反應管置于室溫干燥5min；

6.8)干燥完成后，從磁力架上取下反應管并加入20μl Nulease-free water，充分混勻；

6.9)將反應管放回磁力架上直到 液體澄清；收集上清液到新的管子中并進行下游實驗；

6.10)選作：取1μl稀釋10倍的PCR產物采用高靈敏度DNA生物分析芯片質檢判斷條帶大小。