[發明專利]一種檢測艾滋病治療藥物核苷類逆轉錄酶抑制劑主要耐藥突變位點的引物及其應用

在審

• 申請號: 201610123551.6
• 申請日: 2016-03-04
• 公開（公告）號: CN105624333A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 葉力;梁浩;蔣俊俊;陳榮鳳;梁冰玉;黃頡剛;臧寧;周波;李旭;韋吳迪;劉潔;趙芳凝
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 韋錦捷

1.一種檢測艾滋病治療藥物核苷類逆轉錄酶抑制劑主要耐藥突變位點的引物，其特征在 于，包括檢測HIV-1病毒pol基因的突變位點M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、 M184I、L210W、T215Y和T215F的ASPCR引物，每個突變位點均包括一對野生型PCR擴 增引物及一對突變型PCR擴增引物，每對野生型PCR擴增引物或突變型PCR擴增引物均包 括一條特異性上游引物和一條通用下游引物；

對于M41L位點，其野生型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.1和 SEQIDNO.21，其突變型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.2和SEQ IDNO.21；

對于D67N位點，其野生型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.3和 SEQIDNO.21，其突變型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.4和SEQ IDNO.21；

對于K65R位點，其野生型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.5和 SEQIDNO.21，其突變型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.6和SEQ IDNO.21；

對于K70R位點，其野生型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.7和 SEQIDNO.21，其突變型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.8和SEQ IDNO.21；

對于K70E位點，其野生型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.9和 SEQIDNO.21，其突變型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.10和SEQ IDNO.21；

對于M184V位點，其野生型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.11 和SEQIDNO.21，其突變型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.12和 SEQIDNO.21；

對于M184I位點，其野生型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.13 和SEQIDNO.21，其突變型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.14和 SEQIDNO.21；

對于L210W位點，其野生型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.15 和SEQIDNO.21，其突變型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.16和 SEQIDNO.21；

對于T215Y位點，其野生型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.17 和SEQIDNO.21，其突變型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.18和 SEQIDNO.21；

對于T215F位點，其野生型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.19 和SEQIDNO.21，其突變型PCR擴增引物的上游引物和下游引物分別為SEQIDNO.20和 SEQIDNO.21。

2.權利要求1所述的引物在檢測艾滋病治療藥物核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥突變位點中 的應用，其特征在于，所述的耐藥突變位點為M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、 M184I、L210W、T215Y和T215F。

3.權利要求1所述的引物用于檢測HIV-1病毒NRTI耐藥突變位點M41L、D67N、K65R、 K70R、K70E、M184V、M184I、L210W、T215Y和T215F的ASPCR檢測方法，其特征在于， 具體步驟為：將耐藥突變位點相應的引物以待檢測樣品的cDNA為模板進行PCR擴增，實時 real-timePCR檢測的反應體系共20uL，其中2XSYBRGreenPCRMasterMix10uL，上游引 物和下游引物各0.4uL，待檢樣品cDNA模板2uL，ddH₂O7.2uL；反應程序為：①預變性95℃ 1min，②然后95℃10sec，退火62℃30sec，延伸72℃1min，重復40個循環，③以每5秒 升高0.5℃的速度，從60℃升至95℃，獲得產物的特異性溶解峰；根據熒光信號到達設定閾 值所經歷的循環數CT值判定結果，當CT值小于等于33時，待測樣品中含有擴增引物對應 的基因型，當CT值大于35時，待測樣品中不含擴增引物對應的基因型。